太空诱变宫颈癌细胞的生物学研究

目的:研究太空诱变宫颈癌细胞的生物学特性。方法:将搭载于“神舟四号”飞船飞行返地后的宫颈癌Caski细胞进行单克隆化,观察细胞形态、四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞生长曲线初步筛选出变异株并测定其倍增时间、流式细胞仪检测细胞周期、软琼脂细胞集落培养和裸鼠成瘤实验检测空间诱变细胞的恶性表型。结果:单克隆化后获得1440株细胞克隆,发现空间诱变株出现多种细胞形态;MTT法筛选出4株变异株,其中有两株编号为44F10和17E3的细胞克隆生长速度快于对照组,其细胞周期分布改变,G1期细胞减少,S期细胞增多;而另两株编号为48A9和31F2的细胞克隆生长速度慢于对照组,其细胞周期分布规律与以上两株相反;地面正常对照细胞,地面模拟对照细胞,44F10,17E3,48A9和31F2细胞的平均倍增时间依次为56.54,58.44,52.96,51.46,101.76和88.47h,其中44F10和17E3与对照细胞组比较平均倍增时间降低但无统计学意义,而48A9和31F2与对照细胞之间的差异有统计学意义(P<0.05);软琼脂细胞集落形成率依次为9.7%,9.3%,14.7%,12.1%,0和0.1%,诱变细胞与对照细胞之间的差异有统计学意义(P<0.01);将6组细胞分别注射入裸鼠体内,47d后处死动物,各组裸鼠成瘤率为100%;剥离出肿瘤组织并称重,各组瘤块平均重量依次为0.066,0.066,0.175,0.249,0.011和0.018g,变异组与两对照组的细胞成瘤能力比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:实验证明空间环境可影响肿瘤细胞的生理特性,并且诱导细胞的变异是多向性的。

生物信息学方法大规模筛选肿瘤差异表达基因

目的利用数据库中已有的基因信息快速筛选鉴定出潜在的肿瘤相关基因。方法利用EST数据库中的基因信息,采用数字化差异显示(DDD)方法,对17种不同肿瘤组织的全基因组进行筛选。结果获得了130个上调基因和159个下调基因,大多为编码细胞骨架蛋白、核糖体亚单位的基因以及与物质代谢、细胞周期、信号传导、调节转录和翻译过程有密切关系的基因。这些基因在12号染色体上出现频率最高,而在21号和Y染色体上很少出现。结论生物信息学筛选是一种快速有效的筛选方法。本实验所得结果对今后肿瘤标志物的鉴定奠定了基础,也为肿瘤标志物的筛选策略提供了新的思路。

太空诱变宫颈癌细胞的差异表达基因初探

将搭载于“神舟四号”飞船飞行返地后的宫颈癌Caski细胞进行单克隆化,筛选出生长速度快于对照组、编号为44F10的细胞克隆,G1期细胞减少,S期细胞增多,成瘤能力增强;编号为48A9的细胞克隆细胞学行为与之相反,与对照组差异均有显著性(P<0.05)。为了解太空诱变肿瘤细胞生物学行为改变的机制,从分子水平入手研究经太空诱变的宫颈癌细胞和地面对照细胞的差异表达基因。应用含2747个人类肿瘤相关基因的Oligo双通道芯片研究差异表达基因。分别抽提44F10、48A9组和地面对照细胞的总RNA,逆转录cDNA并标记探针。将实验组和对照组cDNA探针混合,分别与同一张芯片杂交后,用不同的波长扫描荧光强度,从而筛选出差异基因。44F10组有16个基因呈现差异表达,48A9组有36个基因呈现差异表达。差异性表达主要涉及细胞凋亡、细胞增殖、细胞周期调控和信号转导的基因。促进细胞增殖的基因在44F10组中表达上调,而在48A9组中限制细胞增殖的基因表达上调。研究表明,太空诱变宫颈癌细胞的差异表达基因导致了细胞生物学行为的改变。

人源鼻咽癌双价抗独特型抗体疫苗的制备及活性鉴定

目的：构建全人源鼻咽癌双价抗独特型抗体原核表达载体，并对其产物作初步鉴定。方法：利用分子克隆技术依次将G22，150插入到原核表达载体pET25b（＋）中，经菌落PCR，双酶切验证并测序。阳性重组子转化入表达菌株E．coliBL21（DE3），经IPTG诱导表达后，表达的重组蛋白经Histag纯化试剂盒纯化后复性。用Western blot方法鉴定G22-150双价蛋白的表达，ELISA方法分析其蛋白活性，并进一步观察其对外周血单个核细胞的刺激增殖情况。结果：构建的原核表达载体pET25b—G22—150经测序验证，序列正确。双价蛋白G22—150以包涵体形式高效表达，经纯化后纯度达90％以上。Westernblot鉴定表达的蛋白相对分子质量（Ms）约42000，与预期相符。ELISA鉴定复性后的蛋白已恢复活性，并能在体外刺激外周血单个核细胞的增殖。结论：成功获得了有活性的双价抗独特型抗体，为临床对鼻咽癌进行主动免疫治疗提供了理论基础。

用EBV转化的肝癌患者B细胞构建噬菌体单链抗体库

目的构建抗肝癌人源噬菌体单链抗体库。方法体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC。用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因。将ScFv基因与载体连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型ScFv库。结果经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生,经多次PCR,扩增出6种VH(γ、μ)和9种VL(κ、λ)基因,经连接组成54种ScFv基因。将ScFv基因与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061。经四环素抗性筛选,得到库容为1.0×108的初级噬菌体抗独特型抗体库,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为80%。结论用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术,制备全人源抗肿瘤单链抗体(ScFv),这一策略是完全可行的。

用体外致敏联合EB病毒转化技术构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库

目的构建抗肝癌的人源Fab噬菌体抗体库。方法体外致敏并用EB病毒(EBV)转化肝癌患者的外周血单个核细胞(PBMC)。RT-PCR扩增人抗体轻链和重链Fd段基因,将抗体基因分别与载体pComb3连接后,电转化大肠杆菌XLI-Blue,构建噬菌体呈现型Fab抗体库。结果经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生;经PCR扩增出13条轻链基因片段(κ、λ)和28条重链Fd基因片段(γ);电转化构建的噬菌体抗体库库容为1.7×107puf/mL;Fab基因的重组率约为100%。结论用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术,成功构建了全人源抗肝癌Fab组合抗体文库。

鼻咽癌人源抗独特型单链抗体诱导的免疫应答

目的观察鼻咽癌人源抗独特型单链抗体G22ScFv在小鼠体内诱导的免疫应答,探讨其作为鼻咽癌疫苗的可能性。方法在大肠杆菌中诱导表达G22ScFv并进行纯化,以纯化的G22ScFv免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA及竞争抑制ELISA检测免疫小鼠特异性体液免疫应答水平;流式细胞术检测免疫小鼠脾T淋巴细胞表型的变化。结果纯化的融合蛋白纯度达95%以上,且具有良好的反应原性。经ELISA检测,G22ScFv免疫后,小鼠产生了Ab3,且小鼠脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞数量升高。结论G22ScFv可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答,为鼻咽癌人源抗独特型抗体疫苗的临床应用奠定了基础。

Epstein-Barr病毒与肿瘤

Epstein—Barr病毒（EBV）属于疱疹病毒科，在很多肿瘤中都能够检测到，如伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌和淋巴瘤等。EBV致病谱广，在这些肿瘤中扮演的角色不同，其发病机制也不同，研究EBV感染在肿瘤发生发展中的作用有助于揭示疾病发生发展的机制。

用体外致敏的鼻咽癌患者B细胞构建全人源噬菌体单链抗体库

目的构建全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库，为筛选鼻咽癌相关抗原的抗体奠定基础。方法采用体外致敏与EB病毒（EBV）转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞（PBMC），提取总RNA，用RT—PCR技术扩增人抗体重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因，用编码（Gly4Ser）3的互补序列连接成单链抗体ScFv基因（VH-linker—VL），并克隆到噬菌粒载体FUSE5，转化大肠杆菌MC1061，构建噬菌体呈现型ScFv库。结果成功地构建了全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库，库容量为6．5×10^7，约100％的噬菌体基因中有ScFv基因的插入。结论联合应用体外致敏和EBV转化及噬菌体呈现技术构建全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库是可行的，这为进一步筛选鼻咽癌相关抗原的抗体奠定了基础。