油茶长链脂肪酰基CoA合成酶基因1(CoLACS1)分子特征与表达分析

长链脂肪酰基Co A合成酶(LACS)在脂肪酸的合成与分解代谢中起着重要作用。本研究以油茶(Camellia oleifera Abel)国家审定品种华硕(Camellia oleifera Huashuo)种仁转录组数据为基础,根据LACS基因Unigene序列设计引物,分离克隆了油茶LACS1基因全长c DNA序列,命名为CoLACS1(Gene Bank登录号:KJ960228),全长2114 bp,开放阅读框2088 bp,编码695个氨基酸;生物信息学分析显示CoLACS1具有3个B1ock,从分子特征可判断CoLACS1属于LACS家族;氨基酸同源比对显示与其他物种的LACS氨基酸序列具有较高的相似性,其中与拟南芥LACS7相似性为78%,与麻风树、大豆、毛果杨等物种LACS6(peroxisomal)相似性可达80%以上;对CoLACS1进行原核表达分析,构建的p ET30a-CoLACS1载体成功转化至BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达,菌液检测获得预测的目的蛋白(分子量约为76 k D);分析转录组数据中CoLACS1的Unigene序列RTKM值并对CoLACS1进行实时荧光定量PCR分析,结果表明CoLACS1在油茶华硕种子发育各时期平稳表达,表达丰度变化不大,荧光定量结果变化规律与转录组数据分析一致;同时分析华硕种仁不同时期含油率和脂肪酸成分变化,双变量统计分析发现CoLACS1表达模式与油茶油脂积累规律呈显著相关性。本研究为进一步研究油茶油脂积累与代谢的基因调控提供理论依据。

三年桐EST-SSR标记的开发与种质遗传多样性分析

以三年桐品种对年桐发育中的种子为材料,构建c DNA文库,获得3202个原始EST序列,经过去除冗余和低质量序列后,获得1047条非冗余单一序列,利用MISA软件从其中的173个非冗余EST序列中搜索得到212个SSR位点。其中,二核苷酸重复类型为主导（68.39%）,其次是三核苷酸重复类型（25.94%）,其优势基元为AG/CT（43.87%）、AT/AT（19.34%）和AGC/GCT（5.66%）。针对可设计引物的68个序列进行EST-SSR引物设计,结合PCR扩增和数据分析,鉴定出14对多态性标记,用该14对引物对169份三年桐种质资源进行遗传多样性检测,共得到41个等位基因（Na）,平均每对引物扩增出2.93个等位基因,期望杂合度（He）变幅为0.08~0.63,平均值为0.33,多态性信息含量（PIC）变幅为0.08~0.56,平均值为0.3,表明14对EST-SSR标记多态性较高,能较好地反映三年桐种质的遗传多样性。三年桐种质资源按群体进行非加权配对算术平均法（UPGMA）聚类分析,群体间的相似度变幅为0.9604~0.9986,遗传距离变幅为0.0022~0.0404,表明三年桐群体间的遗传多样性相对较低,亲缘关系较近。对169份三年桐种质资源个体进行聚类分析,结果显示不同地理种源的遗传关系缺乏明显的地理结构。

油茶种仁鲨烯合酶基因的分子特性与表达分析

角鲨烯含量是高品质植物食用油评判标准的重要指标之一。鲨烯合酶是角鲨烯合成直接相关的上游调控关键酶。本研究在已构建的油茶种仁转录组数据库基础上,设计特异引物,采用RACE技术获得油茶鲨烯合酶基因的全长cDNA序列,命名为CoSQS(Gen Bank登录号为JX914592)。生物信息学分析结果表明:该序列全长1554 bp,其中含全长的开放阅读框为1245 bp,编码415个氨基酸残基,CoSQS蛋白为弱碱性非分泌型蛋白,具有2个明显的跨膜区和2个角鲨烯和番茄红素合成酶的特异信号区。与柿Dk SQS同源蛋白亲缘关系最近,属于疏水性蛋白。亚细胞定位试验结果显示该基因定位于叶绿体。实时荧光定量PCR分析表明,5-10月间,油茶种仁中CoSQS基因表达量呈现先上升后下降的趋势,转录最高峰在9月下旬。通过关联分析表明CoSQS基因表达量与角鲨烯含量密切相关。

油桐种子脂肪酸延长代谢的转录表达与代谢调控机理研究

油桐是我国四大木本油料植物之一,当前对油桐的研究主要集中在栽培选优及低产林改造方面,而对油桐脂肪酸延长代谢的分子机理研究尚未见报道。本研究以油桐果实膨大期、油脂转化初期和油脂转化高峰期的种子为材料,采用高通量RNA测序技术对油桐种子脂肪酸延长代谢的3个不同时期转录组进行比较,以nr、Swiss-Prot、KEGG和COG 4个蛋白数据库为参考,对油桐种子脂肪酸延长代谢进行了综合性分析。研究结果表明,参与油桐种子脂肪酸延长代谢途径的非冗余基因序列共37条,涉及的主要酶功能基因有9种;在果实膨大期、油脂转化初期和油脂转化高峰期中,调控脂肪酸延长代谢途径的基因存在明显的表达差异。综合分析结果绘制了油桐种子脂肪酸延长代谢途径,揭示了调控油桐种子脂肪酸延长代谢过程的基因作用规律。这些研究结果为油脂合成的遗传改良提供了资源和技术基础,同时为油桐分子设计育种提供了一定的科学依据。

梨自交不亲和基因cDNA芯片杂交条件优化及应用

[目的]优化梨自交不亲和基因(S-RNase或S基因)c DNA芯片杂交条件,利用芯片检测梨品种S基因型。[方法]提取梨品种雌蕊RNA,Cy3标记引物RT-PCR获得S基因荧光标记特异c DNA序列。设置不同杂交条件,用已知S基因型品种荧光标记的PCR产物在不同条件下分别与芯片杂交,杂交信号分析芯片杂交效果。用芯片优化杂交体系鉴定梨品种未知S基因型,DNA测序验证芯片鉴定结果。[结果]芯片杂交最佳条件:杂交温度42℃,杂交时间8~9 h,PCR纯化产物终浓度为200 ng·μl-1。优化杂交条件下芯片鉴定晚咸丰、秀水、丽江马占梨1、湘菊、木通梨、甘甜、弥渡小红梨、丽江大中古、金晶和弥渡火把等梨品种S基因型分别为:Pp S15Pp S52、Pp S4Pp S5、Pb S22Pp S37、Pp S1Pp S2、Pp S1Pp S3、Pp S13Pp S15、Pp S12Pb S42、Pb S21Pb S22、Pp S3Pp S60和Pp S5Pp S5。DNA测序验证各品种所含S基因与芯片鉴定结果一致。[结论]梨自交不亲和基因c DNA芯片优化杂交条件后可准确鉴定梨品种所含已鉴定的S基因资源。