基于RNA-Seq的油茶种子α-亚麻酸代谢途径及相关基因分析

以油茶果实膨大期和油脂合成高峰期的种子为材料,进行转录组测序和表达谱数据库构建,并对油茶种子α-亚麻酸代谢途径相关基因进行分析。转录组测序获得油茶种子α-亚麻酸代谢非冗余基因Unigenes序列共112条,与α-亚麻酸代谢密切相关的不饱和脂肪酸合成途径非冗余基因Unigenes序列94条,包含12种调控α-亚麻酸代谢主要酶基因。表达谱数据分析显示,果实膨大期和油脂合成高峰期的α-亚麻酸合成代谢途径相关基因具有不同的表达模式,参与油茶种子α-亚麻酸的合成及形成多种不饱和脂肪酸的物质转化。采用实时荧光定量PCR方法验证油茶种子LOX,AOS,ACOX,AOC,OPR,AACT,PLA2,HPL,DOX,MFP,FAD2,FAD3等关键基因在油茶种子油脂合成不同时期的相对表达量,结果表明各基因表达规律与表达谱数据分析结果一致。克隆、调控这些相关基因将会为提高α-亚麻酸含量的油茶育种提供依据。

油茶长链脂肪酰基CoA合成酶基因1(CoLACS1)分子特征与表达分析

长链脂肪酰基Co A合成酶(LACS)在脂肪酸的合成与分解代谢中起着重要作用。本研究以油茶(Camellia oleifera Abel)国家审定品种华硕(Camellia oleifera Huashuo)种仁转录组数据为基础,根据LACS基因Unigene序列设计引物,分离克隆了油茶LACS1基因全长c DNA序列,命名为CoLACS1(Gene Bank登录号:KJ960228),全长2114 bp,开放阅读框2088 bp,编码695个氨基酸;生物信息学分析显示CoLACS1具有3个B1ock,从分子特征可判断CoLACS1属于LACS家族;氨基酸同源比对显示与其他物种的LACS氨基酸序列具有较高的相似性,其中与拟南芥LACS7相似性为78%,与麻风树、大豆、毛果杨等物种LACS6(peroxisomal)相似性可达80%以上;对CoLACS1进行原核表达分析,构建的p ET30a-CoLACS1载体成功转化至BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达,菌液检测获得预测的目的蛋白(分子量约为76 k D);分析转录组数据中CoLACS1的Unigene序列RTKM值并对CoLACS1进行实时荧光定量PCR分析,结果表明CoLACS1在油茶华硕种子发育各时期平稳表达,表达丰度变化不大,荧光定量结果变化规律与转录组数据分析一致;同时分析华硕种仁不同时期含油率和脂肪酸成分变化,双变量统计分析发现CoLACS1表达模式与油茶油脂积累规律呈显著相关性。本研究为进一步研究油茶油脂积累与代谢的基因调控提供理论依据。

基于油脂合成期油桐种仁转录组数据的α-亚麻酸代谢途径解析

【目的】油桐种仁中产出的桐油经济利用价值极高。桐油中α-桐酸的含量高达70%,然而植物体内α-桐酸代谢通路的研究还未见报道,这对直接筛选油桐α-桐酸代谢通路相关酶基因造成一定的困难。α-亚麻酸作为α-桐酸的同分异构体,其代谢通路的研究则较为深入,能为α-桐酸代谢通路的解析提供参考。因此,本研究期望在油桐种仁转录组数据的基础上,解析油桐的α-亚麻酸代谢途径,为油桐α-桐酸代谢机理的阐明提供理论参考。此外,通过调控这些基因的表达模式以及开发与之紧密连锁的分子标记,可大大加快油桐遗传改良和分子育种的进程。【方法】采用RNA-Seq技术对油桐种仁3个不同油脂合成期的转录组进行比较,获得大量差异表达的Unigene,并将这些Unigene归类于128个代谢途径。在此基础上,通过GO分类和Pathway富集性分析,解析油桐α-亚麻酸代谢通路并分析通路中相关酶基因在油脂合成期的表达变化规律。【结果】通过对Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ期的油桐种仁RNA测序,共获得长度为200-3000个核苷酸的非冗余Unigene序列58 439条,其中能够比对到公共数据库中已知基因序列的Unigene共有41059条,占所有非冗余基因的70.3%。不同长度的非冗余Unigene序列与数据库中序列匹配的效率不同,越长的序列匹配效率越高。序列长度大于2000 bp的序列匹配效率达到98.28%,而500-1000 bp和100-500 bp的序列分别只有78.86%和48.99%的匹配效率。3个种仁油脂合成期的转录组数据中共有105个Unigene可被富集于α-亚麻酸代谢途径,占所有非冗余Unigene的0.47%。从3个转录组数据的两两比较中鉴别出一些差异表达Unigene,其中也有一些可被富集于α-亚麻酸代谢途径。通过在KEGG数据库中进行检索后发现,105个Unigene序列分别对应于14个α-亚麻酸代谢途径关键酶基因,这些基因在其他物种中都有同源基因与之对应。通过基因表达模式分析发现,整体上与合成代谢相关的基因在油脂合成期呈现上调的表达模式,而与分解代谢相关的基因则呈现下调的表达模式。【结论】在油桐种仁转录组数据的基础上,解析油桐α-亚麻酸代谢途径,获得与α-亚麻酸代谢相关的重要酶基因并分析它们在油脂合成期的表达模式,这对后续研究具有重要的启示作用。

油桐种子脂肪酸延长代谢的转录表达与代谢调控机理研究

油桐是我国四大木本油料植物之一,当前对油桐的研究主要集中在栽培选优及低产林改造方面,而对油桐脂肪酸延长代谢的分子机理研究尚未见报道。本研究以油桐果实膨大期、油脂转化初期和油脂转化高峰期的种子为材料,采用高通量RNA测序技术对油桐种子脂肪酸延长代谢的3个不同时期转录组进行比较,以nr、Swiss-Prot、KEGG和COG 4个蛋白数据库为参考,对油桐种子脂肪酸延长代谢进行了综合性分析。研究结果表明,参与油桐种子脂肪酸延长代谢途径的非冗余基因序列共37条,涉及的主要酶功能基因有9种;在果实膨大期、油脂转化初期和油脂转化高峰期中,调控脂肪酸延长代谢途径的基因存在明显的表达差异。综合分析结果绘制了油桐种子脂肪酸延长代谢途径,揭示了调控油桐种子脂肪酸延长代谢过程的基因作用规律。这些研究结果为油脂合成的遗传改良提供了资源和技术基础,同时为油桐分子设计育种提供了一定的科学依据。

梨自交不亲和基因cDNA芯片杂交条件优化及应用

[目的]优化梨自交不亲和基因(S-RNase或S基因)c DNA芯片杂交条件,利用芯片检测梨品种S基因型。[方法]提取梨品种雌蕊RNA,Cy3标记引物RT-PCR获得S基因荧光标记特异c DNA序列。设置不同杂交条件,用已知S基因型品种荧光标记的PCR产物在不同条件下分别与芯片杂交,杂交信号分析芯片杂交效果。用芯片优化杂交体系鉴定梨品种未知S基因型,DNA测序验证芯片鉴定结果。[结果]芯片杂交最佳条件:杂交温度42℃,杂交时间8~9 h,PCR纯化产物终浓度为200 ng·μl-1。优化杂交条件下芯片鉴定晚咸丰、秀水、丽江马占梨1、湘菊、木通梨、甘甜、弥渡小红梨、丽江大中古、金晶和弥渡火把等梨品种S基因型分别为:Pp S15Pp S52、Pp S4Pp S5、Pb S22Pp S37、Pp S1Pp S2、Pp S1Pp S3、Pp S13Pp S15、Pp S12Pb S42、Pb S21Pb S22、Pp S3Pp S60和Pp S5Pp S5。DNA测序验证各品种所含S基因与芯片鉴定结果一致。[结论]梨自交不亲和基因c DNA芯片优化杂交条件后可准确鉴定梨品种所含已鉴定的S基因资源。