基于“三个一”的生物育种人才实践创新能力培养探索与实践

为解决国家经济社会发展特别是战略性新兴(支柱)产业中培养高素质创新应用型专门人才的迫切问题,以高等院校生物育种人才培养为研究内容,以实践创新能力培养为中心,有机融合了理论教学与实践教学,将实践环节覆盖了培养全过程,构建并实施了“三个一”的实践教学方式,持续改进并切实提升了人才培养质量,对于提高战略性新兴(支柱)产业生物育种人才培养质量以及缓解人才培养与产业需求脱节问题具有现实的指导意义和推广价值。

油莎豆5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因CeEPSPS的克隆与分析

起源于非洲和地中海沿岸的油莎豆以适应性广、产油量高而成为我国的新型油料作物。为促进该物种的开发与利用,研究基于基因组和转录组数据对油莎豆及代表性单子叶植物的EPSPS基因进行系统鉴定。结果表明:与大多数植物类似,油莎豆仅含有1个EPSPS基因,其包含7个内含子,命名为CeEPSPS;RT-PCR分离到的CeEPSPS编码区序列为1584 bp,预测编码514个氨基酸,其N端的前70个残基为叶绿体信号肽,77~508位残基为高度保守的EPSP合酶结构域(PF00275);与EPSP合酶结构域相比,信号肽在不同植物中变异较大;CeEPSPS成熟蛋白的理论分子量为47.32 kDa,等电点为5.49,总平均疏水指数为0.069,脂肪族指数为93.76,不稳定系数为31.73,与其他物种相近,均属于稳定的疏水型酸性蛋白;进化分析支持油莎豆划归为禾本目莎草科。序列比对和基因组测序分析结果显示,56份油莎豆种质不存在已报道的草甘膦抗性变异。qRT-PCR分析结果显示,CeEPSPS主要在成熟叶片和块茎中表达,其表达水平显著高于芽、幼嫩叶片、衰老叶片和芽茎。此外,本研究还构建了CeEPSPS的植物过表达载体,这为下一步的草甘膦抗性育种奠定了坚实的基础。

一个水稻MYB基因的功能初步分析

从水稻中分离获得的一个新的、功能未知的MYB基因,序列分析发现是一个典型的R2R3-MYB转录因子,与拟南芥中的MYB106高度同源,因此命名为OsMYB106。亚细胞定位检测结果表明,OsMYB106蛋白定位于细胞核中。Real Time PCR结果显示OsMYB106在水稻幼穗时期表达最高,并且受干旱、盐处理和冷胁迫的显著诱导上升表达。OsMYB106RNAi抑制植株表现出矮化以及花粉败育。基因表达分析显示花粉发育相关基因OsMS2和CYP704B2在抑制植株中表达显著降低,揭示OsMYB106可能是通过调控OsMS2和CYP704B2介导花粉细胞壁的发育进而影响花粉的育性。

数字PCR在转基因定量检测中的研究进展

数字PCR对核酸分子进行定量检测时不依赖于标准曲线和标准物质,在转基因定量检测中可直接计算出模板中外源基因的拷贝数浓度值和转基因含量。本文概述了数字PCR在转基因定量检测中的应用,将数字PCR与实时荧光定量PCR的技术参数从检测特异性、线性动态范围、准确度、灵敏度、稳健性等方面进行了对比分析,以利其在转基因生物安全管理及转基因标识制度发挥技术支撑作用。本文还阐述了影响数字PCR检测结果的因素,探讨了数字PCR结果溯源至SI单位的可能性,为数字PCR在转基因定量检测以及其它领域核酸精确定量的应用提供参考。

基于单分子实时测序的油莎豆全长转录组分析

油莎豆以其适应性广、产量和含油量高而成为我国的新型油料作物。为解析油莎豆的遗传基础,服务于育种和分子生物学研究,采用单分子实时测序技术构建了油莎豆高质量的全长转录组,混合样本的组织来源包括块茎、匍匐茎、根、芽、叶片、叶鞘、花、花茎等。研究基于23.20 Gb高质量的原始数据提取获得环形一致序列319568条,其平均长度和测序深度分别为2101 bp和43×;通过聚类、校正和去冗余最终得到高质量的序列57849条,合计121.79 Mb;转录组的完整性约为79.58%,其中约有76.20%的为全长转录本;通过比对NR、Swissprot、GO、KOG、eggNOG、Pfam、KEGG等数据库,共获得52424条序列的注释信息,注释比例约为90.62%;此外,研究还预测获得3759条lncRNA、43060个SSR位点以及2300条转录因子序列。这些结果不仅增加了我们对油莎豆遗传特性的认知,同时还为下一步开展基因表达谱分析、功能基因的挖掘与利用等奠定了坚实的基础。

水稻基因OsVDAC3的逆境功能分析

水稻OsVDAC3是编码一个可能12次跨膜的线粒体基因,芯片数据显示该基因在水稻根和花器官中表达最强,并受干旱、盐及多种激素显著诱导。以T1代OsVDAC3超表达转基因植株为材料,实时荧光定量PCR技术检测植株中基因OsVDAC3的表达水平,筛选超表达家系进行盐胁迫和甘露醇胁迫试验,结果显示超表达OsVDAC3能显著增强水稻的抗逆性,表明OsVDAC3是水稻逆境胁迫中的正调控因子。

水稻OsVDAC2基因的克隆及亚细胞定位分析

VDAC(电压依赖性阴离子通道)又称作线粒体孔蛋白,在调节线粒体的代谢和能量功能以及线粒体介导的凋亡中都发挥重要作用。但水稻中VDAC家族的亚细胞定位及其生物学功能尚未清楚。依据NCBI公布的水稻Os VDAC2的ORF序列设计引物,从水稻品种日本晴叶片c DNA中扩增得到目的片段。构建Os VDAC-GFP融合瞬时表达载体,转化水稻原生质体对其进行亚细胞定位。激光共聚焦观察结果表明:水稻Os VDAC2蛋白主要存在于细胞质,为进一步研究其功能奠定了基础。

水稻稻瘟病抗病基因Pi63顺式作用元件的载体构建

水稻稻瘟病抗性基因Pi63具有良好的田间抗性,且抗性与其表达量成正相关,但Pi63表达的调控机制尚未得到研究。为了研究Pi63的抗性机理,通过对Pi63启动子区域顺式作用元件的生物信息学分析,分段构建了4个含有不同顺式作用元件的缺失体,将上述缺失体转入植物双元表达载体pCAMBIA1391Z中。菌落PCR以及质粒DNA酶切鉴定后,经测序进一步确认。结果表明:以上4个缺失体载体构建成功。本研究为进一步研究启动子中不同顺式作用元件对于Pi63基因稻瘟病抗性的影响以及Pi63基因的表达特性奠定了基础。

稻瘟病新抗性基因Pi39候选基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

Pi39是位于水稻第12染色体上的稻瘟病新抗性基因,为了明确其功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建候选基因的敲除载体。通过对候选基因序列分析,将合成的靶位点序列插入入门载体p ENTR-sg RNA,再与表达载体Cas9发生重组。本研究首先在候选基因的第一个外显子区域找到了2个带有PAM序列的靶位点,将2个目的小片段依次克隆到p ENTR-sg RNA载体上。通过菌落PCR检测及测序,结果表明目的小片段插入位置正确。将入门载体与表达载体进行重组反应后,阳性克隆经菌落PCR和质粒DNA酶切鉴定并测序,结果表明重组载体构建成功。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建敲除载体操作简单,耗时短,为进一步开展Pi39候选基因的功能研究奠定了基础。

水稻广谱抗性负调控基因OsSSI2的克隆及原核表达

水稻Os SSI2基因负调控水稻的抗病反应,为了研究该基因的抗性机理,构建p GEX-6P1-Os SSI2原核表达载体,转化大肠杆菌BL21细胞后利用IPTG诱导外源蛋白表达并优化表达条件,使用SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物。结果表明:成功构建了p GEX-6P1-Os SSI2原核表达载体后进行原核表达,在IPTG浓度为0.3 mmol/L,温度为25℃,诱导表达7 h,通过SDS-PAGE和Western Blot检测发现Os SSI2蛋白的可溶性表达量最多,为进一步研究水稻Os SSI2蛋白的抗性机理奠定了基础。

实时荧光PCR定量检测肉制品中猪源性成分

为了准确可靠地对肉制品中猪源性成分进行定量检测,通过生物信息学方法筛选到猪细胞核单拷贝基因(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 2-like,CACA)。以CACA基因为扩增靶标,设计了特异性引物、TaqMan探针,建立了基于实时荧光定量PCR技术检测猪肉含量的方法。实验结果表明,该方法具有良好的种外特异性和种内稳定性,在20~0.032 ng/μL的DNA浓度范围内,模板DNA和扩增Ct值之间存在良好的线性关系,标准曲线为y=-3.508x+28.636,线性决定系数R^(2)为0.997。在相对标准偏差≤25%的条件下,可准确检测猪DNA含量低至0.1%的DNA样品,猪肉含量低至5.0%的肉制品。通过对市售样品的检测,发现有的肉制品中掺有猪肉但未标识,有的配料表中猪肉并非主要成分但实际上猪肉占主要成分。本研究建立的实时荧光定量PCR能够准确可靠对肉制品中的猪肉成分进行检测,对准确鉴别肉制品掺假以及量化肉制品组分具有重要参考价值。

油莎豆块茎油脂积累相关基因CeWRI1的克隆与功能分析

起源于非洲的油莎豆是迄今唯一已知在块茎中高水平积累油脂的新型草本油料作物。基于我国当前食用植物油和生物柴油原料供给紧张的局面,挖掘参与油莎豆块茎油脂积累的关键基因具有重要的理论意义和应用价值。WRI1(WRINKLED1)隶属于AP2/ERF转录因子家族,是一类被证实在油料种子发育过程中控制碳源由糖向油分配的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从油莎豆的块茎中分离到一个WRI1同源基因(CeWRI1),该基因的编码区为1116 bp,预测编码371 AA,其理论分子量为41.58 kDa,等电点为5.76,总平均疏水指数为–0.750,不稳定系数为60.75,细胞核定位,这与其转录调控功能是一致的。与拟南芥WRI1类似,序列分析显示CeWRI1含有2个保守的AP2结构域(PF00847)、1个VYL基序和1个14-3-3/BPM结合基序;相比AP2结构域和N端,其C端序列的变异较大,但包含与蛋白降解相关的PEST基序。qRT-PCR分析显示,CeWRI1在叶片、叶鞘、根、匍匐茎和块茎等主要组织中都有表达,且其在起始期、膨大初期、膨大中期、膨大晚期和成熟期等不同发育时期块茎中呈现先降后升的J型表达趋势,表达丰度最高的为成熟期,最低是膨大中期,这与油脂的积累模式大体一致。在烟草中的功能分析显示,CeWRI1的异源瞬时过表达可显著提高叶片的油脂(甘油三酯)含量,这进一步证实该基因具有油脂调控功能。上述结果表明CeWRI1是调控油莎豆块茎高水平积累油脂的关键基因之一,这不仅为进一步揭示油莎豆块茎油脂积累的调控机制奠定了坚实的基础,也为后期的品种改良提供了宝贵的基因资源。

千里光石油醚提取物对LPS激活的炎症反应的抑制效应

以千里光石油醚提取物(PEESS)为材料,以脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7小鼠单核巨噬细胞为炎症模型,通过CCK-8法检测细胞增殖、Griess法检测一氧化氮(NO)含量、RT-PCR法检测炎症相关因子的表达,及Western blot法检测炎症关键转录激活因子的活化,研究PEESS的抗炎作用及可能的分子机制。结果显示,0~80μg/mL的PEESS对巨噬细胞增殖无明显影响,但能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的分泌,并呈浓度依赖性;炎症相关因子基因mRNA表达检测结果显示:PEESS能显著抑制LPS刺激的RAW264.7细胞炎症模型中IL-1β及IL-6的表达;同时,PEESS还显著降低了NF-κB p65及p44/p22 MAPK蛋白的磷酸化水平。以上结果表明,千里光石油醚提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型具有较好的抗炎效应,其作用发挥可能与其抑制NF-κB和MAPK信号通路的活化以及NO、IL-1β和IL-6等炎症介质的分泌有关。

我国不同区域膳食结构分析及膳食营养建议

结合地理区域与气候特征,综述了我国西北地区、北方地区、青藏地区和南方地区四大地理区域居民的膳食结构,对膳食结构中的植物蛋白和动物蛋白组成情况进行了剖析,对不同区域居民的膳食结构与居民区域性慢性疾病进行了关联分析,并对各区域居民的膳食营养提出了建议,旨为制定科学合理的区域性居民膳食营养指南提供理论基础,为中国“双蛋白工程”及“国民营养计划”的实施提供科学依据。

稻瘟病抗性基因Pita^2候选基因多位点编辑载体的构建

Pita2是定位于水稻第12号染色体着丝粒区域的稻瘟病广谱抗性基因,前期研究中通过精细定位得到了5个候选基因,其功能及作用原理还不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建Pita2候选基因的多位点编辑载体。首先在候选基因外显子区域找到2个含有PAM序列的特异性靶位点序列,并构建候选基因入门载体SK-gRNA,然后利用同尾酶将SK-gRNA重组载体上的目的片段gRNA酶切,采用一步法将2个gRNA连接到双元表达载体p C1300-Cas9。质粒PCR鉴定以及测序的结果表明,以上5个多位点编辑载体构建成功。后期通过遗传转化并鉴定候选基因表达量与抗病性之间的关系,为水稻稻瘟病抗性基因Pita2功能研究奠定基础。

基于ISSR图谱构建华中利川和华东苏杭莼菜品种的分子身份证

采用ISSR分子标记技术获得华中利川莼菜和华东苏杭莼菜品种间的DNA指纹图谱,以构建其分子身份证。利用莼菜基因组DNA的ISSR扩增带型多态性分析数据,对居群间UPGMA聚类分析显示6个莼菜居群形成华中利川和华东苏杭2个分支。个体间UPGMA聚类分析也显示华中利川3个居群的23个莼菜个体聚类成一个分支,而华东苏杭3个居群的23个个体聚类成另一分支。其中,3条核心ISSR引物(P817、P825、P845)扩增产生的指纹图谱,可用于构建苏杭莼菜和利川莼菜2个地域性品种特异的分子身份证。研究结果表明:ISSR标记用于鉴别华中利川和华东苏杭莼菜品种种质资源是有效的,同时揭示了地理位置的隔离及气候地带的差异化与它们在分子水平上的分化是一致的;采用多种分子标记联合构建不同莼菜品种的分子身份证数据库,并与传统性状特征相结合,将有利于更准确地鉴定莼菜品种资源。

不同浓度三聚氰胺对裂足臂尾轮虫急性毒性和生活史参数的影响

[目的]研究不同浓度三聚氰胺对裂足臂尾轮虫的急性毒性和生活史参数的影响。[方法]以裂足臂尾轮虫为受试动物，研究不同浓度（600、l200、1800mg／L）的三聚氰胺对其存活率、繁殖率、生命期望、净生殖率、世代时间和内禀增长率的影响。[结果]急性毒性试验结果表明三聚氰胺对裂足臂尾轮虫的48hLC50为2206．376mg／L，95％置信区间为1822．866-2850．378mg／L。与对照组相比，不同浓度三聚氰氨都显著降低了轮虫的生命期望、净生殖率和世代时间。当三聚氰氨浓度达到1800mg／L时，轮虫的内禀增长率显著降低。[结论]该研究可为评价三聚氰胺的毒性提供一些理论基础。

野葛特异性PCR检测方法的建立与应用研究

一个物种特有的DNA序列可以开发成能够识别该物种及其加工产品的标记.为寻找野葛(Pueraria lobata)特有的DNA序列,建立野葛特异性PCR检测方法,通过对GenBank中野葛基因信息的检索分析,筛选出了同源序列少特异性强的野葛查耳酮合成酶基因作为研究对象.对该基因的特定区域设计引物,建立了野葛特异性定性PCR检测方法.利用该方法对野葛14个不同居群的DNA进行PCR扩增,均能扩增出226 bp的片段.而用相同引物分别对20种其他植物的DNA进行扩增均未出现特异性扩增产物.PCR灵敏度实验结果表明该方法的检测灵敏度达到0.02 ng基因组DNA,对市场上的葛根产品进行检测结果表明该方法可以有效鉴定葛根产品中是否含有野葛成分.该野葛特异性PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可用于野葛成分的检测与鉴定.

水稻OsAAA1基因超表达载体构建及遗传转化

为了构建带Flag标签的OsAAA1超表达载体,获得阳性转基因植株并分析其OsAAA1基因表达情况。以日本晴的cDNA为模板,将OsAAA1克隆至p U1301-Flag载体;重组质粒通过PCR、酶切及测序鉴定正确后,以农杆菌为介导进行遗传转化至日本晴;转基因植株通过分子鉴定正确后,采用Real-time PCR检测OsAAA1基因的mRNA表达水平变化。成功构建了OsAAA1-pU1301-Flag重组载体;遗传转化后获得33株转基因植株;通过分子鉴定筛选出26株阳性转基因植株;荧光定量PCR结果分析发现23株阳性转基因植株OsAAA1基因的表达出现不同程度上调。与日本晴相比,有8株表达量达到30倍以上,其中有5株表达量超过40倍。成功构建了带Flag标签的OsAAA1超表达载体;遗传转化结果表明OsAAA1-Flag能整合到日本晴的基因组DNA中,从而使OsAAA1基因的表达水平增加。本研究为后续通过Flag标签,在水稻植物体内直接挖掘与OsAAA1互作的功能蛋白奠定了基础。

酸奶慕斯配方优化及其在营养学实践中的应用

以酸奶、奶油、吉利丁粉、绵白糖为主要原材料,采用感官检验法、单因素试验和正交试验等方法,对产品在加工过程中各种原材料的添加量对酸奶慕斯风味和品质的影响进行探究,最终确定出酸奶慕斯的最佳工艺配方:黄油10 g、饼干碎20 g、奶油53 g、酸奶53 g、吉利丁粉2.1 g、绵白糖9 g、纯净水15 g。参照《中国食物成分表》对其营养价值进行评估,结果表明研制出的酸奶慕斯蛋糕是一款口感细腻醇厚、营养价值丰富的西式甜点。将该研究应用于食品质量与安全专业本科生的食品工艺学和营养学教学实践,一方面有助于加深学生对食品加工工艺和营养价值分析方法的了解,另一方面有利于引导和激发学生对营养调查相关知识学习和研究的兴趣。