重楼种子外种皮提取物对水稻种子萌发及幼苗生长的影响

研究重楼种子外种皮提取物有机酸、生物碱、酚类对水稻种子萌发的影响。分别采用碱提酸沉法、酸提法、乙醇浸提法提取重楼种子外种皮中的有机酸、生物碱、酚类,梯度稀释后处理水稻种子,分析提取物对水稻种子48 h的萌发率、第10天对苗高、鲜质量以及胚根长的影响。以蒸馏水（CK）作对照。试验结果,3类提取物与CK相比,在2.5~50.0 mg/m L的处理浓度范围内对水稻种子48 h的萌发率、第10天的苗高、鲜质量、胚根长都有抑制作用。在2.5~5.0 mg/m L的低浓度范围内,3类提取物对种子萌发率的抑制作用相差不大,对苗高、鲜质量抑制作用的强弱顺序依次是酚类〉生物碱〉有机酸,而在10~50 mg/m L的高浓度范围内,3类提取物对种子萌发率、苗高、鲜质量的抑制作用的强弱顺序依次为：生物碱〉酚类〉有机酸。此外,还发现每类提取物对胚根长度的抑制作用要强于对其他指标的抑制,且在整个处理浓度范围内抑制作用的强弱顺序是：生物碱〉酚类〉有机酸。通过研究明确了3类物质对种子萌发抑制作用的效果,确定了有机酸、生物碱、酚类是存在于重楼种子外种皮中的3类萌发抑制物,研究结果为深入研究重楼种子的休眠机制提供了理论依据。

2011年鄂西地区水稻稻瘟病菌遗传多样性的分析

[目的]扩大鄂西地区稻瘟病菌菌库,分析其群体结构。[方法]收集鄂西不同地区2011年间的感病稻秆,分离保存稻秆上的穗颈瘟病菌,通过RAPD、rep-Pot2-PCR、REMAP 3种标记对分离的菌株进行分子标记。[结果]从9个稻秆上共分离得到29个稻瘟病菌。遗传多样性分析结果表明,相似性水平在75%时,2011年供试菌株可分为5个遗传宗谱,宗谱3(7个菌株)和4(19个菌株)为优势宗谱,其余3个为稀有宗谱。[结论]2011年鄂西地区稻瘟病菌由5个遗传宗谱组成。

北虫草CNZ虫草酸提取方法的筛选和优化

为获得北虫草(Cordyceps militaris)CNZ虫草酸最适的提取方法,比较了6种虫草酸提取方法,结果表明超声辅助醇提法虫草酸的得率最高,达113.31 mg/g,可作为初始提取方法。进一步通过单因素试验和正交试验优化提取次数、固液比、超声时间、乙醇浓度等条件,获得北虫草CNZ虫草酸提取条件为:乙醇浓度20%(体积分数),固液比1∶10(g∶mL),超声时间20 min,提取次数3次;在优化的提取条件下,北虫草CNZ虫草酸得率为161.06 mg/g,与初始提取条件相比提高了42.1%。

红花油脂相关性状与SSR分子标记的关联分析

红花(Carthamus tinctorius L.)是一种富含不饱和脂肪酸的重要油料作物。为寻找与红花油脂性状相关联的分子标记,本研究利用已经开发的多态性良好的48对SSR引物,系统分析了来自27个国家74份红花种质资源的遗传多样性和群体结构,并结合红花油脂相关性状的表型数据,应用TASSEL3.0中的一般线性模型(GLM,general linear model)和混合线性模型(MLM,mixed linear model)对红花油脂性状和标记进行关联分析。研究结果显示:48对SSR分子标记的多态性信息含量(PIC)变异范围为0.0632~0.3750,平均值为0.2937;基因多样性指数变异范围为0.0653~0.5000,平均值为0.3700。UPGMA聚类将74份红花分为3个类群,分别包括7份、52份和15份材料。群体结构分析结果显示,74份红花可分为3个亚群,各亚群分别包括7份、55份和12份材料。在显著水平P<0.05条件下,通过GLM和MLM两种模型都检测到了18个与油脂性状相关联的分子标记,各标记对表型变异的解释率变幅分别为5.42%~20.69%和4.35%~20.69%。两种分析方法相比,除标记Ct589和Ct178不同外,剩余16个标记在两种分析方法中都能检测到。研究表明:所选74份红花种质资源的群体遗传多样性丰富,结构差异性显著,适合用于红花油脂相关性状的关联分析。本研究为高含油量红花辅助育种提供了新的分子标记资源。

水稻线粒体基因orf290功能的初步研究

从红莲型不育系粤泰A(YTA)线粒体基因组中克隆并鉴定了一个6.7kb的CMS相关片段HLsp1,序列预测发现了2个orf,其中一个编码290个氨基酸,暂命名为orf290。构建带有线粒体信号肽的超表达载体35S::Rf1b5'::orf290,通过农杆菌介导转化受体保持系粤泰B(YTB),以水稻的单拷贝基因蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为内参基因,以潮霉素抗性基因(hpt)作为目的检测基因,基于实时荧光定量PCR鉴定转基因T0代植株中外源基因的拷贝数,并对阳性植株进行花粉镜检和结实率统计。结果显示获得了2株单拷贝转35S::Rf1b5′::orf290植株,并且都有orf290的表达。单拷贝超表达orf290植株的平均花粉可育度30.8%,平均套袋结实率41.6%。这些结果初步证实,线粒体基因orf290可能与水稻细胞质雄性不育相关。

外源NO对重楼种子活力及超弱发光的影响

【目的】探究NO对重楼种子萌发质量的改善效果,解决重楼种子萌发困难的问题,为重楼种子促萌研究提供基础。【方法】以滇重楼和七叶一枝花的种子为研究对象,采用100 μmol/L NO供体—硝普钠处理种子,以相同条件清水处理为对照,记录重楼种子萌发过程的形态变化和发芽率,并借助电子倍增式CCD的超弱光图像探测系统,检测种子在萌发期间的自发超弱发光强度,研究硝普钠处理后重楼种子自发超弱发光强度的变化。【结果】硝普钠处理的种子比对照提前20 d萌发;在种子萌发后0～30 d,对照与硝普钠处理的种子自发超弱发光无显著差异;在萌发培养后40～60 d,硝普钠处理种子的自发超弱发光强度明显高于对照。【结论】在重楼种子萌发过程中,硝普钠处理具有明显改善种质、促进种子萌发的作用。

鄂西南地区24个水稻品种稻瘟病发病比较

为比较24个水稻品种在鄂西南不同地区稻瘟病发病情况,筛选适合鄂西南种植的水稻品种,在2018、2019年分别在鄂西南10个地点(忠路、来凤、巴东、建始、长阳、鹤峰、宣恩、柏杨和咸丰,以武汉黄陂作对照)种植24个水稻品种,调查叶瘟和穗颈瘟发病情况。结果表明,2019年各地点的发病情况明显高于2018年,10个地点中发病最严重是宣恩,而咸丰2年都没有品种发生稻瘟病。在实验的24个品种中’荣优华占’抗性最好,适合在鄂西南推广种植。

鄂西南地区稻瘟病菌AVR-Pia动态变化研究

为了解鄂西南地区稻瘟病菌AVR-Pia的分布和动态变化,于2017—2020年在鄂西南9个地点同时种植特定100个水稻品种,采集感病稻杆并分离稻瘟病菌;利用水稻单基因系IRBLa-A进行致病性鉴定,设计无毒基因AVR-Pia特异性引物进行PCR扩增和序列分析。结果表明2017—2020年分离保存的661株稻瘟病菌菌株中,有49株含有无毒基因AVR-Pia(占7.4%),不同年份及不同地点AVR-Pia出现频率差异明显,2017—2020年分别为7.5%、16.0%、3.1%、5.0%,AVR-Pia出现频率最高的是野三关(15.8%),其次是柏杨和来凤(都是14.6%),咸丰、建始和太平未出现。含Pia的单基因系IRBLa-A对其中91个菌株(13.8%)具有抗性。49个菌株能扩增出463 bp的特异性条带,序列分析发现其CDS区域未发现突变,起始密码子上游109 bp位点发生碱基突变G/T,该位点变异是否与表达相关有待进一步研究。说明鄂西南地区无毒基因AVR-Pia存在较少,抗性基因Pia不适合在鄂西南地区作为主效抗病基因来选择育种。

HL-CMS同质异核近等基因恢复系‘L-Rf6’的构建

为了研究红莲型水稻中2个恢复基因与2个不育基因的互作关系,用红莲型水稻不育系‘粤泰A’(‘YTA’)与恢复系‘9311’杂交,所得F1代再与保持系‘粤泰B’(‘YTB’)多次回交,最终构建了与不育系‘YTA’同质异核的近等基因恢复系‘L-Rf6’。根据Rf5和Rf6的基因序列设计了特异性分子标记,并对‘L-Rf6’进行检测。结果显示成功构建了近等基因恢复系‘L-Rf6’。对近等基因恢复系的不育基因orfh79的表达量进行分析,结果显示‘L-Rf6’中orfh79的表达量与‘YTA’比较明显下降。该近等基因恢复系的构建为阐述红莲型水稻多个恢复基因与多个不育基因的互作关系打下基础。

水稻可溶性OsVDAC5蛋白的外源表达及鉴定

通过生物信息学分析确定水稻(Oryza sativa L.)Os VDAC5的可溶性肽段,将相应的编码区克隆于p GEX-4T-1原核表达载体中,进行IPTG诱导表达和GST亲和层析纯化,利用SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白。结果表明,成功构建的p GEX-4T-1-Os VDAC5(1-75aa)原核表达载体,经过体外IPTG诱导,在35 k Da处可检测到可溶性目的蛋白,并获得外源蛋白表达的最适温度为15℃和最佳诱导时间为8 h;经过GST亲和层析,SDS-PAGE可检测到较为单一的蛋白条带,得到纯化的GST-Os VDAC5(1-75aa)融合蛋白。

水稻HL-CMS细胞质雄性不育基因的体外转录及Northern Blot检测

[目的]通过基因克隆和体外转录技术获得水稻红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)不育系粤泰A(YTA)中的2个细胞质雄性不育基因orf216和orfH79的RNA,为Northern Blot检测提供阳性定量标准品,并可作为凝胶阻滞试验的底物,用于研究与恢复基因编码产物的相互作用,从而为阐释不育基因与恢复基因的相互作用分子机制奠定基础。[方法]以红莲型胞质雄性不育基因orf216和orfH79的特异引物,利用不育系YTA为材料,PCR扩增获得相应片段,分别连接至pGEM-T Easy质粒并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,补平粘性末端,以rN4为底物、用依赖于DNA的RNA聚合酶进行体外转录,转录产物用DNase处理除去DNA模板,纯化并测定RNA浓度,并用Northern Blot验证。[结果]获得了细胞质雄性不育基因orf216和orfH79各自的RNA,经检测orf216浓度为1.286μg/μl,A260/A280为2.01;orfH79浓度为1.006μg/μl,A260/A280为2.10。[结论]运用体外转录技术获得的RNA片段条带单一,纯度较高,可用于体外大量获取目的 RNA。

新型不育胞质在栽培稻中的分布与鉴定

为了分析只含有不育基因orf216在栽培稻中的分布,鉴定具有新的细胞质雄性不育胞质类型的种质资源。选取栽培稻824个品系为研究对象,以细胞质雄性不育相关序列HL-Sp1的特异引物进行PCR扩增,初步筛选得到9个候选品系,利用细胞质雄性不育基因orf H79,orf216的特异引物进行PCR扩增完成进一步筛选,并用Southern杂交验证。结果表明,最终筛选出IR72892,IR43,IR73546 3个只含有不育基因orf216不含orf H79的新型细胞质雄性不育胞质类型的品系。通过分子标记辅助选择,已成功的从824个栽培稻种中筛选到新的具有细胞质雄性不育胞质类型的新品系,为后续不育系的培育和相关理论研究奠定基础。

水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因表达载体的构建

[目的]构建水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[方法]利用长片段PCR在抗白叶枯病水稻品种扎昌龙中扩增长10.6 kb的候选基因,将其通过Asc I单酶切克隆至植物表达载体pCAMBIA1300中,并对阳性克隆进行质粒PCR、酶切检测和测序分析。[结果]试验成功构建了水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[结论]该研究为进一步研究Xa31(t)基因的功能奠定了基础。

水稻HL-CMS育性恢复蛋白的原核表达及纯化

将水稻目地基因Rf6连接到载体PMD-18T上,测序正确后将目的片段连接到含有GST标签的p GEX-6P-1原核表达载体上,确认正确的重组质粒转化到BL21菌株;通过LB培养至对数生长期后,加入IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot检测是否诱导出目的条带,并且经过Glutathione Resin亲和层析系统纯化及检测。结果表明,20℃,4 h,0.3 mmol/L IPTG条件下可诱导出可溶性蛋白,经纯化得到可溶性带GST标签的融合蛋白。

水稻OsV3IP2和OsV3IP3原核表达与鉴定

通过生物信息学分析确定OsV3IP2和OsV3IP3的可溶性肽段,获得可溶性的OsV3IP2和OsV3IP3外源表达蛋白质,将相应的编码区克隆于原核表达载体p ET32a中,进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白质。结果表明,利用生物信息学软件对蛋白质的二级结构进行预测,将OsV3IP2、OsV3IP3分别分为2个和4个部分。将其分别克隆到p ET32a后,采用0.2 mol/L IPTG在10、20、30℃诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,证明OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1表达的融合蛋白存在于上清液中,而OsV3IP 3-2、OsV3IP 3-3表达的融合蛋白存在于沉淀中,获得了OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1可溶性目的蛋白,为进一步体外验证OsVDAC3与OsV3IP2、OsV3IP3的互作奠定了基础。

转sm-Ngt1基因水稻遗传稳定性分析

为检测转sm-Ngt1基因株系后代的遗传稳定性,对连续2年种植的15个转sm-Ngt1基因T4代水稻株系进行了阳性鉴定,并以农业部要求的9对引物对转基因标记物进行检测,同时对其农艺性状进行了统计。结果显示,15个转基因株系中,编号1、3、5、7-9、11-15这11个转基因株系中含有sm-Ngt1基因,除编号8株系外,sm-Ngt1基因在其余10个株系中均能稳定遗传;在9对检测标记物引物中5对能扩增出特异性条带,其中3对引物(NOS-F1/NOS-R1、T35S-F1/T35S-R1、NPTF68/NPTR356)在所有转基因水稻株系后代中(T5、T6代)都能扩增出特异性条带,2对引物(35S-F1/35S-R1、HPTF226/HPTF69)检测结果与sm-Ngt1检测结果相同。结果表明编号1、3、5、7、9、11-15的10个转基因株系中含有35S启动的sm-Ngt1基因和HPT基因能稳定遗传,且这些转基因株系生育期、株高、结实率及千粒重与受体品种之间差异不显著。

重楼地上部分四种重楼皂苷含量的分析

目的通过检测重楼地上部分的重楼皂苷含量,评价其药用开发价值。方法采用超声法提取地上部分的重楼皂苷;采用HPLC法检测重楼皂苷的含量,色谱条件:色谱柱为Venusil XBP C18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈:水梯度洗脱,检测波长为210 nm。结果通过考察不同的色谱柱、洗脱方式、柱温、流速等,建立了有效的分离重楼皂苷I、II、VI、VII的色谱条件;通过比较不同提取方法,选取了相对较简便省时、稳定可靠的提取方法;通过对果皮、外种皮、叶片、地上茎、种子的4种重楼皂苷含量的检测,发现不同地上部分的4种重楼皂苷含量差异较大,五种地上部分材料中均含重楼皂苷VII。结论果皮、外种皮的重楼皂苷VII含量较高,具有潜在的药用开发价值。