树突状细胞受曲霉菌抗原冲击后的变化

目的探讨树突状细胞(DCs)在曲霉菌免疫中的作用以及曲霉菌抗原冲击对DCs功能的影响。方法小鼠骨髓制备DCs,于小鼠尾静脉接种,以3H-TdR掺入法检测DCs刺激小鼠脾脏T细胞分化能力,ELISA方法检测IFN-γ和IL-12的浓度,电镜观察DCs的形态,同时进行DCs的表型测定。结果电镜下可见DCs细胞形态不规则,表面伸展出大量树突,与曲霉菌共同培养后胞内含有大量的烟曲霉孢子,部分孢子的膜被破坏;与烟曲霉孢子共培养24h后,DCs细胞表形CD40、CD80、CD86的表达明显增高,产生IL-12p70约(700.40±93.75)pg/ml,明显高于对照组(141.96±52.06)pg/ml;烟曲霉抗原冲击DCs回输小鼠的脾脏T细胞增殖能力明显增强,体外接受烟曲霉抗原24h产生IFN-γ(1084.33±238.04)pg/ml,明显高于单纯DCs接种小鼠的脾脏T细胞(345.98±32.75)pg/ml(p<0.01)。结论DCs能吞噬并破坏加热灭活的烟曲霉孢子,并趋于成熟,抗原呈递能力增加。

重组腺病毒AdmIL-12对树突状细胞的基因转染

目的:应用重组腺病毒AdmIL-12转染树突状细胞(DC)制备DC疫苗。方法:以重组腺病毒AdmIL-12转染DC后,用流式细胞仪检测DC的表型,用RT-PCR检测IL-12在DC内的表达,用EILSA法测定细胞培养上清液中的mIL-12和mIFN-γ的含量。通过IL-12刺激T细胞分泌IFN-γ的能力以检测DC分泌的IL-12的生物活性。结果:重组腺病毒AdmIL-12能高效转染DC,转染后DC的表型无显著改变,转染DC能大量分泌具有生物活性的IL-12。结论:腺病毒AdmIL-12成功转染DC,获得有效的DC疫苗。

应用特异性抗原刺激树突细胞增强小鼠抵抗烟曲霉感染的能力

目的探讨曲霉抗原刺激树突细胞(DC)应用于小鼠后对小鼠抵抗曲霉感染能力的影响。方法小鼠骨髓制备DC,尾静脉接种小鼠;腹腔内注射环磷酰胺后,鼻腔内滴入烟曲霉孢子制备侵袭性肺曲霉病小鼠模型;获取小鼠肺组织并进行匀浆,假丝酵母(念珠菌)显色培养基接种后进行菌落计数,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测mγ干扰素(ndFN-γ)含量,部分肺组织进行HE和GMS染色;以反转录．聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测小鼠脾脏中细胞因子IFN-γ的mRNA表达。结果与单纯接种DE和热灭活烟曲霉(HAF)的小鼠相比,烟曲霉抗原刺激DC回输的小鼠存活率显著增高,脾脏内IFN-γ的mRNA表达增加,肺组织烟曲霉负荷明显降低,肺组织匀浆中IFN-γ含量(3．60±1．57ng/ml)亦高于非刺激DC免疫小鼠(HAF．1．35±0．47ngml;单纯DC,1．1±0．42ngml,P＜0．01),接受单纯DC和HAF的小鼠肺组织可见烟曲霉孢子、菌丝生长,有支气管壁的破坏,支气管周围坏死,肺泡和间质内炎症细胞浸润,而接受烟曲霉抗原刺激DC的小鼠肺内浸润炎症细胞减少,未发现坏死和真菌生长。结论应用烟曲霉抗原刺激DC,可以在小鼠体内诱导特异性Th1型反应．增强小鼠抵抗烟曲霉感染的能力。

侵袭性肺曲霉菌病鼠模型的建立及γ-干扰素和肺组织细菌负荷的动态变化

目的建立侵袭性肺曲霉菌病模型,探讨不同免疫状态对小鼠抵抗曲霉菌感染能力的影响。方法2006年1月至12月于中国上海生命科学院生物细胞所通过腹腔内注射环磷酰胺后鼻腔内滴入烟曲霉菌(Af)孢子制备侵袭性肺曲霉菌病小鼠模型;获取小鼠肺组织并进行匀浆,接种培养后进行菌落计数,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测γ-干扰素(IFN-γ)质量浓度,部分肺组织进行苏木精-伊红(HE)和六胺银(GMS)染色;以反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测小鼠肺脏IFN-γ的mRNA表达,观察小鼠死亡率。结果免疫抑制小鼠接种烟曲霉菌后萎靡少动,呼吸急促,口周围出血严重,很少进食水,多随时间延长而表现恶化,肺部真菌负荷呈明显增加趋势,支气管肺泡灌洗液(BALF)中IFN-γ质量浓度随时间推移逐渐升高,48h后保持于较高水平[(932.6±208.36)ng/L],约50%小鼠3d内死亡。病理显示对照组小鼠于接种烟曲霉菌后,支气管旁有大量多型核白细胞(PMN)聚集,炎症呈灶性分布,肺泡壁增厚。免疫受损(ICH)组接种烟曲霉菌后,炎症弥漫分布,肺泡及间质水肿出血剧烈,烟曲霉菌孢子、菌丝呈灶状分布,至48h出现支气管壁破坏、支气管周围坏死、大量炎症细胞浸润,烟曲霉菌菌丝集落成簇出现。结论肺部细胞因子IFN-γ质量浓度与曲霉菌负荷呈一定相关性,机体的免疫功能、T细胞介导的免疫在拮抗曲霉菌感染中发挥着重要作用。