小鼠细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析

目的利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2蛋白,并对其免疫原性分析。方法将优化后的MVM VP2序列克隆至表达载体pFastBac1,命名为pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至DH10Bac感受态大肠杆菌中形成重组杆粒,提取重组杆粒经PCR鉴定正确后转染昆虫细胞Sf9,镜下观察到细胞明显病变后收获重组杆状病毒rBac-MVM VP2。Sf9细胞接重组病毒48和72 h后,用间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证重组蛋白的免疫原性。结果构建的rBac-MVM VP2重组杆状病毒感染Sf9细胞后,可成功表达MVM VP2重组蛋白,经Western blot和IFA检测分析,重组蛋白具有较好的免疫原性且在病毒感染72 h时表达量较高。经蛋白纯化后可得到纯度较高的VP2重组蛋白。结论本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达MVM VP2蛋白并具有良好的免疫原性,为VP2相关功能的研究和临床诊断方法的建立奠定基础。

三种小鼠肠道病毒多重PCR检测方法的建立和初步应用

目的建立一种同时检测小鼠细小病毒(MVM)、肝炎病毒(MHV)和诺如病毒(MNV)的多重PCR检测方法。方法分别根据MVM、MHV和MNV基因保守区应用软件设计特异性引物,构建在同一反应体系中可同时检测MVM、MHV和MNV的多重PCR检测方法,验证其特异性、敏感性及重复性,并进行初步检测应用。结果通过优化PCR扩增条件成功建立多重PCR检测方法,特异性实验结果表明,该方法可同时扩增MVM、MHV和MNV的目的片段,片段大小与预期相符,未出现非特异性片段;敏感性测试显示,MVM、MHV和MNV三种病毒的最低检测下限为10^(2)、10^(4)、10^(2) copies/μL;重复性实验显示该方法在不同时间、不同场所应用的重复性稳定。应用该方法对287份小鼠结肠匀浆样品进行检测,与单重PCR检测结果完全一致。结论所建立的MVM、MHV和MNV三种病毒多重PCR检测方法具有特异性高、敏感性强和重复性优的特点,适用于三种病原体感染的临床样品检测和大量样品的流行病学调查。