—80℃短期冻存对NK细胞功能及杀伤活性的实验研究

目的探讨一80℃短期冻存不同时间对NK细胞功能及杀伤活性的影响。方法采集和分离健康人外周血单个核细胞,在体外培养扩增NK细胞,扩增12d后将部分NK细胞于一80%冻存1、4、12、24周。用流式细胞仪分别检测冻存前后NK细胞的表型、凋亡百分率、穿孔素、颗粒酶B及CDl07a的表达;用LDH法检测并比较冻存前后的NK细胞对食管癌细胞株的杀伤活性。结果一80Y:冻存1、4、12周的NK细胞与未冻存的NK细胞比较表型、凋亡百分率、穿孔素、颗粒酶B、CDl07a表达及对食管癌的杀伤活性,差异无统计学意义(P>0.05)。而冻存24周的NK细胞与未冻存的NK细胞比较表型、凋亡百分率、穿孔素、颗粒酶B、CDl07a表达及对食管癌的杀伤活性,差异均有统计学意义(P<O.05)。结论一80'E冻存NK细胞12周以内对细胞的功能及杀伤活性没有影响。

白藜芦醇抑制结肠癌干细胞增殖并增强MICA/B的表达

目的研究白藜芦醇(Res)对结肠癌干细胞(CCSC)增殖、凋亡和免疫原性的影响。方法采用无血清培养法由HCT116结肠癌细胞诱导培养CCSC,通过检测CCSC标志物CD133、CD44进行鉴定。MTT法检测Res对CCSC增殖的影响;annexinⅤ-FITC/PI双染色结合流式细胞术检测Res对CCSC凋亡的影响;流式细胞术检测Res对CCSC生长周期及主要组织相容性复合体Ⅰ类分子相关链A/B(MICA/B)表达的影响。结果 HCT116细胞在无血清培养下成球生长。球形细胞中CD133+细胞占91.07%±1.79%,CD44+细胞占90.33%±1.78%。与对照组相比,Res能明显抑制CCSC增殖,并且呈时间、剂量依赖性;Res作用48 h后,CCSC细胞周期G0/G1期比例显著升高,S期下降,呈剂量依赖性;随着药物浓度增加,CCSC的凋亡率增加,MICA/B的表达增强。结论从HCT116结肠癌细胞成功诱导培养出CCSC,Res能剂量依赖性地抑制CCSC的增殖,与阻滞细胞于G0/G1期,并诱导细胞凋亡有关;Res能增强CCSC中MICA/B的表达,增强其免疫原性。

根皮素对人γδT细胞杀伤胃癌SGC-7901细胞的影响及机制探讨

目的：探讨根皮素对人γδT细胞杀伤胃癌SGC-7901细胞的影响及其机制。方法：IPP法扩增人外周血γδT细胞,不同浓度的根皮素作用于γδT细胞及胃癌SGC-7901细胞48小时后,MTT法检测γδT细胞及SGC-7901细胞的生长曲线,FCM检测γδT细胞PFP及GraB的表达;LDH释放法检测γδT细胞对SGC-7901细胞的杀伤活性;Western blot检测γδT细胞中Wnt3a的表达情况。结果：IPP作用10天后,γδT细胞比例由3.12%增加到79.6%。与对照组比较,浓度2.3518.75μg/ml的根皮素作用后γδT细胞的增殖率显著提高（P〈0.05）,75μg/ml根皮素对SGC-7901细胞生长抑制率显著提高（P〈0.05）,且2.3575μg/ml根皮素作用后的γδT细胞对SGC-7901细胞的杀伤活性明显增强（P〈0.05）,γδT细胞中PFP、GraB及Wnt3a的表达较对照组显著增加（P〈0.05）。结论：根皮素能够增强γδT细胞对SGC-7901细胞的杀伤作用,其机制可能与根皮素促进γδT细胞的增殖,提高γδT细胞PFP、GraB表达及活化Wnt信号通路有关。

一种体外扩增γδT细胞的新方法

目的:建立一种新的γδT细胞扩增方法。方法:从健康人外周血中分离外周血单个核细胞(PBMCs),与用唑来膦酸预处理过的未成熟DCs按10:1混合,在含IL-2 400 U/ml和10%小牛血清的RPMI1640培养基中培养,用MTT法测定细胞增殖倍数。用流式细胞仪对γδT细胞进行表型分析并检测其细胞内的颗粒酶B、穿孔素和CD107a含量。用乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测细胞杀伤活性。结果:经唑来膦酸预处理的树突状细胞与自身外周血单个核细胞共培养,到11天时γδT细胞增殖倍数达到(120±15)倍,第8天和11天γδT细胞百分率分别达到70.26%±3.56%、90.11%±4.67%。γδT细胞细胞内颗粒酶B、穿孔素及CD107a在第8天时分别为81.66%±4.32%、86.62%±5.21%和80.12%±3.78%,均高于对照组。培养的γδT细胞对SGC-7901、SW-1990、SW-480肿瘤细胞株杀伤活性至第8天时达到峰值。结论:此法能有效诱导γδT细胞体外扩增,培养的γδT细胞颗粒酶B、穿孔素及CD107a均显著高于对照组,并有较强的抗肿瘤活性。

银杏叶提取物增强细胞因子诱导的杀伤细胞杀伤肿瘤细胞活性的研究

探讨银杏叶提取物对人细胞因子诱导的杀伤细胞 ( CIK细胞 )杀伤肿瘤细胞活性的影响。在体外用不同浓度的银杏叶提取物诱导人 CIK细胞和肿瘤细胞 ,以观察银杏叶提取物对人 CIK细胞活性和对肿瘤细胞的影响。在银杏叶提取物浓度为 50 0μg/ ml,作用CIK细胞 4h后能明显增强 CIK细胞杀伤肿瘤细胞的活性 ,与对照组和其它浓度组相比 P<0 .0 1 ;CIK细胞对经银杏叶提取物处理后的 K562 (人红白血病细胞株 )和 SGC-790 1 (人胃癌细胞株 )杀伤活性也明显高于对照组 P<0 .0 1。银杏叶提取物在一定浓度时能明显提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性 ;经银杏叶提取物处理的 K562和 SGC-790 1更易被

3种不同抗凝剂对外周血培养的NK细胞功能影响

目的探讨外周血经3种不同抗凝剂处理后培养的自然杀伤(NK)细胞的增殖率和杀伤功能的影响研究。方法采集10例年龄(35±5)岁健康志愿者15 m L外周血,分别置于含乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2,EDTA组)、细胞保存液(细胞保存液组)和肝素钠(肝素钠组)的抗凝管中。用淋巴细胞分离液收集单个核细胞,在NK细胞培养液中培养单个核细胞12 d,并观察细胞生长情况。在第4、6、8、10、12天时,收集细胞用CCK8法检测NK细胞的增殖情况。在细胞增殖最明显的第12天收集细胞,通过流式细胞仪检测各组NK细胞的颗粒酶、穿孔素和CD107a。台盼蓝染色检测细胞活性。通过CCK8法检测各组对肿瘤细胞株K562杀伤活性。结果通过细胞增殖发现,EDTA组NK细胞增殖不明显,肝素钠组和细胞保存液组增殖明显。第12天时检测发现,肝素钠组增殖倍数为128.15±6.38,细胞保存液组增殖倍数为107.51±5.70;肝素钠组优于细胞保存液组(t=6.20,P=0.00)。肝素钠组NK细胞纯度表达为(84.49±2.35)%,也明显高于细胞保存液组NK细胞表达[(77.63±1.37)%]。经台盼蓝染色检测,肝素钠组和细胞保存液组细胞活性率均为100%。通过流式细胞仪检测发现,肝素钠组NK细胞颗粒酶B、穿孔素和CD107a的表达都明显高于细胞保存液组(t=12.76、17.76、5.67,P=0.00、0.00、0.00)。对肿瘤细胞株K562杀伤结果显示,肝素钠组NK细胞杀伤活性(50.12%±3.42%)明显高于细胞保存液组(41.88%±2.47%)(t=4.78,P=0.001)。结论肝素钠和细胞保存液均可用于NK细胞培养的血液抗凝,但肝素钠组NK细胞的杀伤功能明显优于细胞保存液组。

手术分娩对产妇和新生儿血中T淋巴细胞的影响

目的探讨手术分娩对产妇和新生儿T淋巴细胞亚群数量的影响。方法足月分娩产妇60例,依据分娩方式及手术时机分为自然分娩(NL)组、择期剖宫产(PCS)组、急诊剖宫产(ECS)组各20例;分别采集分娩时的产妇外周血和新生儿脐血,应用流式细胞仪检测T细胞各亚群的百分比。结果 NL组、PCS组、ECS组产妇血中T淋巴细胞亚群CD3+(69.15±13.24)%、(73.50±4.86)%、(68.68±7.50)%;CD3+CD4+(32.03±9.44)%、(36.35±11.82)%(、34.88±7.54)%;CD3+CD8+(29.83±6.01)%、(30.59±7.30)%、(28.08±4.09)%;CD4+/CD8+1.09±0.37、1.33±0.65、1.25±0.27各组间差异均无统计学意义(P>0.05);新生儿脐血:PCS组中由于CD4+的减少而呈现CD4+/CD8+的比值明显低于NL、ECS组,分别为2.71±0.86、3.52±1.50、3.30±1.03(P<0.05)。结论产妇血中T淋巴细胞亚群数量不受手术分娩以及产程影响;PCS可能会加剧新生儿对某些病原体的易感性。

唑来膦酸对人末梢血γδT细胞杀伤胃癌细胞株SGC-7901作用的影响

目的:探讨唑来膦酸对人末梢血γδT细胞杀伤SGC-7901作用的影响.方法:异戊烯焦磷酸法体外扩增人外周血γδT细胞,用不同浓度的唑来膦酸诱导γδT细胞和SGC-7901细胞株24h,MTT法检测唑来膦酸对这两种细胞生长抑制率的影响和LDH法检测γδT细胞的杀伤活性,流式细胞术检测诱导前后的γδT细胞和SGC-7901的凋亡率.结果:γδT细胞培养10d时从扩增前4.21%增加到70.35%,CD44达94.0%.唑来膦酸各浓度对SGC-7901细胞株的抑制率均明显高于γδT细胞,当唑来膦酸的浓度在5-25μmol/L时γδT细胞负抑制率呈剂量依赖关系,且γδT细胞的杀伤活性也逐渐增强,且于25μmol/L时杀伤活性最强,唑来膦酸诱导γδT细胞和SGC-7901细胞株24h,γδT细胞凋亡率明显低于SGC-7901(3.57%vs56.70%,P<0.05).结论:唑来膦酸在临床常规使用浓度下,能够促进γδT细胞的增殖,同时能够抑制肿瘤细胞的生长,且能够增强γδT细胞的杀伤活性.

羽扇豆醇对胰腺癌细胞株SW1990及γδT细胞生长的影响

目的:探讨羽扇豆醇对人胰腺癌细胞SW1990及γδT细胞生长的影响.方法:采用本实验室体外扩增人外周血γδT细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度的羽扇豆醇在不同时间段对人γδT细胞和人胰腺癌细胞SW1990生长的影响.本实验分3组:空白对照组、溶剂对照组和实验组,时间段分24、48、72h组.结果:羽扇豆醇浓度在0.4-200μg/mL时羽扇豆醇对人胰腺癌细胞SW1990在24、48、72h各组与空白对照组和溶剂对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).而24、48、72h3组比较差异无统计学意义.γδT细胞培养7d从扩增前的3.61%增加到80.2%,羽扇豆醇对γδT细胞在24、48、72h随浓度的增加先增值后抑制作用.24h与空白对照组和溶剂对照组比较差异无统计学意义.48、72h各组与空白对照组和溶剂对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:羽扇豆醇对人胰腺癌细胞SW1990有抑制作用,对γδT细胞随着浓度增加有先促进后抑制作用.

手术分娩对产妇和新生儿血中NK细胞的影响

目的:探讨手术分娩对产妇和新生儿血NK细胞数量的影响。方法:足月分娩产妇60例,其中自然分娩(NL)组、择期剖宫产(PCS)组、临产后剖宫产(ECS)组各20例。分别采取分娩即刻的产妇外周血和新生儿脐血,采用流式细胞仪检测血中NK细胞的百分数。结果:血中NK细胞百分数在产妇中3组无差异(P>0.05);PCS组的新生儿血中NK细胞百分数明显低于NL组(P<0.05),同时也低于其母体产妇(P<0.01)。结论:手术分娩不影响产妇血中NK细胞数;择期剖宫产减少新生儿血中NK细胞数,手术分娩儿增加了对病原体的易感性。

姜黄素对CIK细胞杀伤胃癌细胞株SGC-7901作用的影响及其机制的研究

目的探讨姜黄素对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)杀伤胃癌细胞株SGC-7901作用的影响及其机制。方法10名健康者外周血单个核细胞(PBMC)在体外经多种细胞因子诱导为CIK细胞;收集培养第5天的CIK细胞,给予不同浓度的姜黄素诱导,37℃、5%CO2条件下继续培养72 h,LDH法检测CIK细胞对SGC-7901细胞的杀伤活性;FACS法检测CIK细胞表型CD3+CD8+、CD3+CD56+含量及穿孔素、颗粒酶B水平。结果①姜黄素诱导后,CIK细胞杀伤胃癌SGC-7901的活性明显提高,在10μmol/L时杀伤活性显著高于对照组(P<0.05)。②姜黄素诱导后,CIK细胞内穿孔素和颗粒酶B的水平明显提高(P<0.05)。③姜黄素能够显著增加CIK细胞的CD3+CD56+表达(P<0.05),降低其CD3+CD8+表达(P<0.05)。结论姜黄素能提高CIK细胞对胃癌细胞株SGC-7901的杀伤活性,其机制可能与其增加CIK细胞穿孔素和颗粒酶含量以及增加CD3+CD56+表达有关。

金丝桃苷增强人NK细胞增殖及功能的研究

目的:研究金丝桃苷对人NK细胞增殖及功能的影响。方法:常规方法扩增健康人外周血NK细胞。用不同浓度的金丝桃苷作用于细胞,CCK-8法检测增殖。流式细胞仪检测NK细胞处理前后颗粒酶、穿孔素的表达。ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ、FasL、TNF-α的表达。结果:金丝桃苷各浓度组对CD3-CD56+的比例无明显影响,但在1.6~8.0μg/ml时能显著促进NK细胞增殖,并提高颗粒酶和穿孔素的表达。金丝桃苷在1.6~40μg/ml浓度能明显促进NK细胞分泌FasL、IFN-γ,但对TNF-α的分泌无明显影响。结论:一定浓度范围内金丝桃苷能增强NK细胞的增殖及功能。

吡罗昔康提高γδT细胞杀伤胃癌细胞作用的机制研究

目的探讨吡罗昔康提高γδT细胞杀伤胃癌细胞作用的机制。方法按常规方法培养γδT细胞;在培养第9天的γδT细胞中加入不同浓度吡罗昔康(分别为0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mmol/L)诱导,24 h后收集培养上清液用于细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素12(IL-12)检测,沉淀细胞用流式细胞术测定穿孔素、粒酶B和NKG2D及用LDH法检测γδT细胞杀伤胃癌细胞活性。结果吡罗昔康浓度为0.04 mmol/L时诱导的γδT细胞穿孔素和粒酶B分别为78.7%和71.8%,明显高于对照组(分别为51.4%和60.9%)。吡罗昔康能显著抑制γδT细胞NKG2D的表达,并随着药物浓度的增加作用越明显。γδT细胞经吡罗昔康诱导24 h后,培养上清液中IFN-γ和IL-12浓度与对照组比较没有明显变化;但能抑制TNF-α的分泌,并且随着药物浓度的增加抑制作用越明显。γδT细胞杀伤胃癌细胞BCG-823的活性在0.04 mmol/L时最高(75%),明显高于对照组(58%)。结论经吡罗昔康诱导后γδT细胞杀伤BCG-823活性明显增高的机制可能与γδT细胞表达较高浓度的穿孔素和粒酶B有关。

乙肝患者自身CD3AK细胞抗病毒近期疗效观察

目的 观察抗CD3单克隆抗体激活的杀伤 (CD3AK)细胞过继回输治疗乙型肝炎的近期治疗效果。方法 从乙肝病人外周血获得单个核细胞 (PBMCs) ,用抗CD3单抗和IL_2体外诱导培养 ,7天后将培养的CD3AK细胞回输给病人 ;平均 1个疗程回输细胞数为 8～ 10× 10 9;检测T细胞亚群和HBVDNA含量变化情况。结果 CD3AK细胞过继回输治疗后 ,CD3 + 、CD4+ 、CD8+ 细胞均比治疗前明显增高 ;随着免疫治疗时间的延长 ,HBVDNA含量呈下降趋势。结论 CD3AK细胞过继免疫治疗可增强患者的细胞免疫功能 ,降低血清病毒含量 ,是一种安全有效的乙肝治疗方法。

手术分娩时机对母婴血中CD4^+ CD25^+ CD127^(low)调节性T细胞的影响

目的探讨手术分娩时机对母、婴血中CD4+CD25+CD127low调节性T细胞(Treg)的影响。方法正常初产妇60例,按分娩方式分为阴道分娩(VD)、择期手术分娩(PCS)、急诊手术分娩(ECS)三组,每组20例,用流式细胞仪检测分娩时母体外周血和新生儿脐血T细胞中Treg百分数。结果新生儿脐血中Treg三组间比较差异无统计学意义(P>0.05),但PCS组明显高于VD组(P<0.05);母体外周血中Treg,三组中ECS组>PCS组>VD组,ECS组显著性高于VD组(P<0.01);三组母体、新生儿血中Treg均无相关性(P>0.05)。结论 PCS时新生儿血中Treg增高,可能会对婴儿免疫系统发育有一定的影响;分娩过程异常的ECS母体血中Treg增高可能与产妇免疫失衡有关。

不同抗凝剂对外周单个核细胞增殖影响比较、γδ T细胞鉴定

目的探讨3种抗凝剂保存的外周血对培养γδT细胞的增殖和杀伤功能的影响研究。方法选择获得知情同意的6例健康志愿者,其中男性3例,女性3例;年龄25~45岁。常规无菌抽取新鲜外周血15 mL。将其外周血标本分别置于肝素钠、细胞保存液(枸橼酸钠)和乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂中(即肝素钠组、细胞保存液组、EDTA组),并立即处理培养细胞,用CCK-8法检测3组细胞的增殖情况。在第10天,行流式细胞术检测3组γδT细胞的穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达。结果在外周血细胞培养过程中,EDTA组细胞增殖不明显;肝素钠组和细胞保存液组细胞增殖明显,在第14天细胞增殖倍数最大分别为137.00%±1.44%和99.00%±1.45%,且肝素钠组优于细胞保存液组(t=2.72,P<0.01)。流式细胞仪检测发现肝素钠组γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达都明显高于细胞保存液组(t=3.871,P=0.003;t=2.744,P=0.021;t=2.261,P=0.047)。结论肝素钠和细胞保存液均可用于γδT细胞培养的血液抗凝,但肝素钠保护γδT细胞的杀伤功能明显优于细胞保存液。

手术麻醉对分娩时母婴免疫的影响

目的探讨围生医学中手术麻醉对分娩时母婴免疫功能的影响。方法正常初产妇分为自然分娩（NL）组、择期手术分娩麻醉（PCS）组、急诊手术分娩麻醉（ECS）组，每组20例，用流式细胞术检测分娩时母体外周血和婴儿脐带衄巾B细胞、T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、γδT细胞的百分比并进行比较。结果母体血中ECS组的B细胞和NKT细胞明显高于NL组、PCS组；婴儿脐血中PCS组的B细胞、NK细胞和T淋巴细胞CD4^＋／CD8^＋明显低于NC组和ECS组（P〈0．05），γδT细胞显著高于NL组和ECS组（P〈0．01）。结论急诊手术分娩对母体免疫方面的改变与自身应激反应有关，不影响婴儿的细胞免疫状态；择期手术分娩影响婴儿免疫状态。

重组人p53腺病毒联合奥沙利铂对结肠癌细胞的生长抑制作用

目的观察外源p53基因在结肠癌细胞内的表达、对肿瘤细胞生长的影响,及对结肠癌细胞化疗敏感性的作用和机制。方法用重组人p53腺病毒注射液(rAd-p53)及奥沙利铂(OXA)单独及联合作用于结肠癌细胞株SW1116不同时间后,CCK-8法检测其对体外培养细胞的抑制率,免疫组织化学S-P法检测p53蛋白的表达情况,流式细胞仪(FCM)分析其细胞凋亡蛋白caspase3的表达情况。结果rAd-p53及OXA单独作用时,随药物浓度及作用时间的增加,细胞的生长抑制率逐渐增高;二者联合作用24 h,在较低浓度时细胞生长抑制率即明显增高(P值均<0.05);OXA(6.25μg/ml)与rAd-p53(5×105、5×106、5×107、5×108、5×109vp/ml)联合作用24 h后,与对照组比较,结肠癌细胞caspase-3蛋白的含量升高,但p53蛋白无明显升高。结论OXA和rAd-p53单药可抑制结肠癌细胞SW1116的生长,二者联合对结肠癌细胞的抑制作用增强;rAd-p53有增强OXA化疗敏感性的作用,其机制与通过线粒体途径激活下游的caspase-3诱导细胞凋亡有关。

宫缩对母子血中NK细胞的影响

目的探讨宫缩对新生儿NK细胞数量的影响。方法足月分娩产妇40例，分为自然分娩的宫缩（UC）组和择期剖宫产的无宫缩（UCL）组，各20例。分别采集分娩即刻的母体外周血和新生儿脐血，采用流式细胞仪检测血中NK细胞的百分数并进行统计分析。结果母体2组NK细胞百分比差异无统计学意义（P〉0．05），新生儿UCL组明显低于UC组（P〈0．05）。结论分娩时母体细胞免疫功能低下；无宫缩过程可导致新生儿脐血NK细胞数量减少，可能会增加新生儿对某些病原体的易感性。

手术分娩对产妇和新生儿血中γδT细胞的影响

目的探讨不同分娩方式对产妇和新生儿血中γδT细胞数量的影响。方法足月分娩产妇60例,依据分娩方式和手术时机分为自然分娩(NL)组、择期剖宫产(CS)组、急诊剖宫产(CS-E)组,各20例。分别采集分娩时的产妇外周血和新生儿脐血,采用流式细胞仪检测γδT细胞的百分数。结果 NL组、CS组、CS-E组γδT细胞百分数,在产妇血中分别为(11.19±8.99)%,(9.00±5.23)%,(11.98±5.24)%,各组间比较差异无统计学意义(P>0.05);在新生儿脐血中依次为(1.29±0.36)%,(4.67±3.47)%,(1.24±0.67)%,CS组显著性高于其他两组(P<0.01)。结论手术分娩对产妇血中γδT细胞影响不明显,择期剖宫产可致新生儿脐血中γδT细胞的增高。