2015年中国医学遗传学研究领域若干重要进展

2015年中国医学遗传学稳步发展,众多具有原创性的研究论文在国际顶级杂志上发表。中国科学家在医学遗传学的诸多领域,如罕见疾病的致病基因、复杂疾病的易感基因、癌症的体细胞突变、遗传学新方法新技术、疾病相关微小RNA(micro RNA,mi RNA)、疾病相关长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)、疾病相关竞争性内源RNA(Competing endogenous RNA,ce RNA)、疾病相关可变剪接和分子进化等研究领域均取得了突破性的进展。中国科学家在医学遗传学研究中逐步从常见变异延伸到罕见变异,从遗传学现象的描述到功能机制的确证,从单组学分析扩展至多组学数据整合,从基础研究走向临床应用。同时,中国科学家的研究成果引起了国际同行的高度关注。本文概括性综述了2015年中国科学家在医学遗传学领域取得的若干重要研究进展,旨在追踪当前中国医学遗传学领域发展的前沿,与国内读者分享我国科学家在该领域取得的重要成果以及研究思路。

LC-MS/MS法测定人血浆中抗辐射新药E0703和代谢物E0703-tone的质量浓度及药动学研究

目的建立同时测定人血浆中E0703及其代谢物E0703-tone的LC-MS/MS分析方法,并应用于E0703在人体内的药动学研究。方法以5-雄烯二醇为内标,血浆样品用乙腈沉淀蛋白后,以乙腈-体积分数0.1%甲酸水溶液(体积比85∶15)为流动相经CAPCELL PAK C_(18)M GIII色谱柱分离,质谱检测采用电喷雾离子源(ESI)正离子化方式,以多反应监测(MRM)方式分别监测离子对m/z 339.2→253.1(E0703)、m/z 337.4→269.1(E0703-tone)和m/z 273.2→159.2(内标)。8名健康受试者单次口服E0703 20 mg,在不同时刻采集血浆样品进行LC-MS/MS分析,采用Phoenix 64(Win Nonlin6.4)的非房室模型计算药动学参数。结果 E0703和E0703-tone标准曲线的线性范围均为1~500μg·L^(-1)(r≥0.99),批内精密度分别≤8.0%和9.1%,批间精密度分别≤14.4%和13.3%;准确度分别为-10.0%~6.0%和-5.1%^-1.4%。E0703进入人体内迅速代谢为E0703-tone,E0703-tone的达峰时间为(1.28±0.76)h,达峰质量浓度为(28.9±19.8)μg·L^(-1),血浆消除半衰期为(2.61±0.44)h。结论本方法适用于E0703人体药动学研究。

一个中国遗传性血色病家系致病基因的突变分析

遗传性血色病(Hereditary hemochromatosis,HHC)是一种罕见的常染色体隐性遗传病。本课题组招募了一个HHC的近亲婚配家系,包括一名患HHC的先证者以及同一代的4名不患HHC的成员。通过对该HHC先证者进行全外显子组测序,在目前已知的与遗传性血色病相关的5个基因(HAMP、HJV、TFR2、FPN和HFE)中,发现在铁调素调节蛋白(Hemojuvelin,HJV)的编码基因HJV上存在两个纯合突变(c.G18C和c.GC962_963AA)。其中,前者能够引起HJV蛋白发生p.Q6H的改变,但该突变的危害性较小,可能与血色病的发病无关;后者能够引起HJV蛋白发生p.C321X的改变,从而翻译出缺失糖基磷脂肌醇锚定结构域的截短型HJV蛋白。除了HJV基因上的纯合突变外,该先证者还携带了其他12个纯合突变,但这些突变的危害性均不强且其所在基因的功能与铁代谢无关。本实验室内部测序数据显示,在一般中国人群中不存在p.C321X突变,提示HJV基因上的p.C321X纯合突变可能是该HHC患者的致病性突变。与此相一致的是,4名不患HHC的家系成员中该位点为野生型纯合子或杂合子,均非p.C321X纯合子。文章首次报道了HJV p.C321X纯合突变可导致HHC,该结果将有助于遗传性血色病的基因诊断和产前咨询。

应激性胃黏膜损伤发病机制的研究进展

应激性胃黏膜损伤(stress-induced gastricmucosal lesions)是由于手术创伤、休克、烧伤等应激引起胃黏膜保护机制与损伤机制发生失衡而出现的以溃疡或糜烂为特征的严重并发症.其病理表现为胃黏膜广泛而表浅的糜烂,发病机制复杂,尚未完全阐明.目前认为是由神经内分泌失调、胃黏膜保护屏障受损、损伤因子增强、细胞凋亡等多因素共同作用的结果.本文对此作一简要综述.

组蛋白去乙酰化酶抑制剂的构效关系研究进展

组蛋白去乙酰化酶介导核小体结构改变和调节基因表达,参与细胞周期进程和分化,并且与多种疾病如癌症、急性髓性白血病、病毒和感染等的发生与发展有关,研究其抑制剂对上述疾病的治疗具有重要意义。组蛋白去乙酰化酶抑制剂按结构类型分为:异羟肟酸类、羧酸类、苯甲酰胺类、亲电酮类、环肽类等。本文从结构与活性关系的角度综述了近年来组蛋白去乙酰化酶抑制剂的构效关系研究。

卷烟烟气对细胞线粒体氧化损伤的研究

目的研究卷烟烟气凝集物(cigarette smoke condensate,CSC)对人乳头状病毒永生化的人支气管上皮细胞(human papillomavirus-immortalized human bronchial epithelial cell line,BEP2D)线粒体的氧化损伤。方法采用分子探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)和氢化乙啶(hydroethidine,HE)检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;用荧光标记物MCB(Monochlorobimane)、壬基吖啶橙(nonyl acridine orange,NAO)、四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide,JC-1)检测细胞内还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)及线粒体内膜心磷脂(cardiolipin,CL)、膜电位(mitochondrial membrane poten-tial,Δψm)。结果CSC作用BEP2D细胞后,细胞内ROS显著增加,GSH及线粒体CL、Δψm水平明显下降,并呈现较好的剂量效应关系。结论CSC可造成细胞线粒体氧化损伤。

中枢兴奋药莫达非尼的研究

莫达非尼是用于治疗发作性睡病的一种独特的中枢兴奋药物。其作用机制目前还不清楚,但与其他兴奋剂不同,莫达非尼可高度选择性的作用于中枢神经系统,对纹状体内的多巴胺活性影响较小,显示出较低的滥用潜能。在迄今为止的临床研究中,莫达非尼显示了良好的安全性及有效性。本文对莫达非尼的化学性质、药代动力学特点、作用机制、临床应用、不良反应及耐药性问题等方面的研究进展进行了综述。

四妙勇安汤活性部位灌胃给药的急性毒性实验研究

目的观察四妙勇安汤活性部位(SMAF)灌胃给药的急性毒性。方法通过预实验,未获得动物的半数致死量,进行最大耐受量试验。选取昆明小鼠及Wistar大鼠各40只,雌雄各半,均分为给药组(20只)及对照组(20只),雌雄各半,给药组采用一次最大浓度和最大容积灌胃给药,小鼠灌胃剂量为6.0 g/kg,大鼠灌胃剂量为3.0 g/kg,对照组灌胃等容积0.5%羧甲基纤维素。观察给药14 d内,大、小鼠的行为、体质量、进食量、死亡率及毒性反应,计算药物的最大耐受量。结果给药后14 d内,与对照组相比,给药组雌雄小鼠、大鼠活动、行为、眼睑、分泌物、呼吸、腹形、排便等均无异常,未见因药物引起的死亡。给药组雌雄小鼠、大鼠给药后7、14 d体质量与对照组同期比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药组雌雄小鼠、大鼠药后7、14 d进食量与对照组同期比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药14 d后,处死各组小、大鼠,与对照组比较,给药组均未见脏器明显的肿大、萎缩、坏死、充血、出血、水肿等异常现象。四妙勇安汤活性部位一次性灌胃给药对小鼠最大耐受量>6.0 g/kg(相当于人日推荐量的360倍);对大鼠最大耐受量>3.0 g/kg(相当于人日推荐量的180倍)。结论 SMAF灌胃给药没有明显毒性。

人宫颈癌细胞(Hela)内的^(31)P核磁共振研究

建立了无损伤性31PNMR研究细胞内物质的实验方法,并对人宫颈癌细胞(Hela)的31PNMR谱中含磷小分子代谢物的谱峰进行了分析;细胞内无机磷(Pi)的化学位移对pH非常敏感,通过测定其化学位移可间接确定细胞内的pH,Hela细胞内Pi峰的化学位移为5.88±0.01(n=3),计算得到细胞内pH值为7.05±0.01;通过测量Hela细胞的31PNMR谱中ATP的α磷和β磷及γ磷的化学位移差值,得出Hela细胞内Mg2+与ATP结合的复合物MgATP和整个ATP量的比值,计算得到Hela细胞内游离Mg2+浓度为(253.3±0.13)mmol/L(n=3),与其它分析方法相比,31PNMR测定细胞内游离Mg2+浓度具有对细胞样品无损伤的优点.

抗菌肽的内源性表达调控研究进展

Toll样受体(toll-like-receptor,TLR)是联系固有免疫与适应性免疫的重要桥梁,TLR的激活可以直接引发抗菌肽的分泌并提高杀菌活性。近年来研究证实1,25-(0H)_2-D_3作为重要的免疫调节剂,与TLR通路介导的固有免疫反应存在着重要的内在联系.本文综述了目前这方面的研究进展。

GCF低表达宫颈癌HeLa细胞系的构建及辐射对其调控IER5基因表达的初步探究

目的构建GCF低表达的宫颈癌He La细胞系,在60Coγ射线照射下初步探究其细胞增殖以及调控宫颈癌放射敏感基因IER5的表达。方法经带有荧光标记的GCF低表达的质粒稳定转染He La细胞,G418筛选,蛋白印迹法、实时定量PCR法鉴定得到GCF-shRNA-He La单克隆细胞系。倒置显微镜观察细胞形态变化,CCK-8法探究不同剂量照射后的细胞增殖情况,在不同照射剂量下用蛋白印迹法检测GCF-shRNA-He La及对照细胞中IER5蛋白的表达情况。结果成功构建稳定表达的GCF-shRNA-He La单克隆细胞系,显微镜下观察GCF-shRNA-He La细胞比正常He La细胞体积小,细胞间隙较大,其中梭形细胞较多。蛋白印迹法及实时定量PCR验证了GCF-shRNA-He La的蛋白表达及mRNA转录水平均低于对照组(P<0.05)。辐射情况下实验结果显示在同一照射剂量、同一时间下GCF-shRNA-He La细胞比control对照细胞增殖缓慢(P=0.014)。不同剂量照射情况下蛋白印迹法检测He La细胞、control-shRNA-He La与GCF-shRNA-He La细胞IER5蛋白表达情况,结果同一辐照剂量下GCF沉默的细胞系中IER5的表达量比对照细胞高,4Gy照射的GCF-shRNA-HeLa的IER5表达量最高(P<0.05)。结论本实验构建了低表达GCF的He La细胞系,初步探讨GCF作为IER5基因抑制性转录因子的作用。结合临床基因靶向治疗,可寻求可以降低GCF表达的方式,通过上调IER5表达这一双效途径来加速宫颈癌细胞凋亡。

高功率微波辐射后豚鼠听性脑干反应阈值的变化

目的本研究运用同一波段、不同功率的微波对豚鼠照射,观察豚鼠微波辐射前后听力的变化。方法选取听力正常的SPF级雄性Hartley豚鼠,随机分为对照组、30m W/cm^2组100m W/cm^2组,于辐射前、辐射后即刻、3天、7天、14天测定听性脑干反应阈值。结果100 m W/cm^2组辐射后ABR阈值升高,即刻、3天、7天、14天ABR阈移与对照组差异有显著统计学意义(P<0.05);30m W/cm^2组阈移与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论本实验条件下的结果表明,高功率微波辐射可导致豚鼠ABR阈值升高,但损伤作用与辐射的功率有关。

曲妥珠单抗相关心脏毒性监测研究进展

曲妥珠单抗是靶向人类表皮生长因子受体2(HER2,又称ErbB2)的人源化单克隆抗体.心脏毒性是曲妥珠单抗治疗过程中最主要的毒副作用,因此,对于其相关机制的探索研究及从临床研究中探索监测手段能更好地指导曲妥珠单抗的安全用药.本研究主要就曲妥珠单抗心脏毒性的机制,曲妥珠单抗相关心脏毒性的诊断、监测及预测手段的研究进展,生物标志物及基因多态性对于曲妥珠单抗相关心脏毒性的监测意义做了系统的综述.

贯叶连翘治疗脑卒中后抑郁对照研究的Meta分析

目的探讨贯叶连翘治疗脑卒中后抑郁的临床疗效及安全性。方法检索并选取1978～2011国内外公开发表的有关贯叶连翘治疗脑卒中后抑郁的临床随机对照试验文献,并用RevMan5.0软件进行Meta分析。结果共有10项研究符合纳入标准①抑郁疗效改善方面的比较:与常规抗抑郁药组比较,贯叶连翘治疗脑卒中后抑郁在抑郁疗效功能改善方面有效率无显著性差异(P>0.05)。与常规治疗组比较,贯叶连翘治疗脑卒中后抑郁在抑郁疗效功能改善方面有效率有显著性差异(P<0.05);②神经功能恢复方面的比较:与常规抗抑郁药组比较,贯叶连翘组治疗脑卒中后抑郁在神经功能恢复方面有效率有显著性差异(P<0.05)。与常规治疗组比较,贯叶连翘组治疗脑卒中后抑郁在神经功能恢复方面有效率有显著性差异(P<0.05)。结论①在治疗脑卒中后的抑郁疗效改善方面,贯叶连翘组与常规抗抑郁药疗效相当,与常规治疗组比较疗效显著。②在神经功能恢复方面,贯叶连翘组与常规抗抑郁药组和常规治疗组比较,疗效均显著。

全基因组关联研究发现8p21.3区域的INTS10基因是一种新的抑制HBV感染的抗性基因

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是最常见的病毒性传染病之一,全球大约有2.5亿HBV慢性携带者。我国大约有7500万HBV慢性携带者,位列全球各国之首。HBV感染后可能引发一系列肝脏疾病,包括慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌。因此,预防和治疗HBV慢性感染意义重大。成年个体感染HBV后,绝大多数个体可以清除病毒,只有少部分个体(~10%)会发展成为慢性感染者。病毒因素和环境因素均可能导致这种个体化差异。

趋化因子受体CXCR4在肾癌组织中的表达及其调控机制研究

目的研究趋化因子受体CXCR4在肾癌患者肿瘤组织中的表达水平,探讨CXCR4表达调控的可能机制。方法收集肾癌患者(未接受放化疗)的肿瘤组织和癌旁组织,将组织研磨后提取RNA,采用实时定量RT-PCR检测肿瘤组织和癌旁组织中CXCR4的表达水平;采用实时定量RT-PCR检测肾小管细胞HKC以及肾癌细胞系769P和786O中TGF-β的表达水平。复制缺陷型腺病毒Ad(E1-).s T和对照病毒感染786O细胞后24 h,采用2 ng/ml的重组人TGF-β刺激24 h,收集细胞,采用实时定量RT-PCR检测目的基因CXCR4的表达水平。同时,病毒感染后24 h,采用划痕法检测786O细胞的迁移能力。结果在肾癌患者中,肿瘤组织的CXCR4表达显著高于癌旁组织:12例患者中,有8例表达上调。与正常肾小管细胞相比,肾癌细胞系769P和786O中,CXCR4的上游分子TGF-β表达上调。在786O细胞中,TGF-β刺激可以显著提升CXCR4的表达水平;而Ad(E1-).s T可以在786O细胞中高效介导sT GF-βRIIFc的高效表达,并抑制CXCR4的表达和细胞的迁移能力。结论 CXCR4在肾癌组织中普遍表达上调,并受到TGF-β的调控,有望成为肾癌治疗的重要靶标。

对凝血酶诱导血小板活化分子机制的研究

目的:探讨凝血酶诱导血小板活化分子的机制。方法:对36例健康人的血液标本的实验资料进行回顾性研究。对这36例健康人的血液标本均使用Western blot(蛋白质免疫印迹法)进行蛋白免疫实验。然后,观察这些健康人的血小板经凝血酶活化后其关键蛋白表达变化的情况。结果:与未进行活化的血小板相比,经凝血酶活化后血小板内Akt蛋白磷酸化的水平显著升高,其关键蛋白PTEN蛋白、p27蛋白和p21蛋白的表达水平则显著下调。在一定范围内,凝血酶对血小板内关键蛋白的作用效应具有时间和浓度的依赖性。结论:凝血酶可通过激活血小板内的PTEN/PI3K/Akt的信号通路而发挥作用,并可通过调控血小板内细胞周期蛋白的表达诱导血小板的活化。

中红外激光晶体Er∶YSGG的生长及LD泵浦的激光性能

采用提拉法成功生长出了Er∶YSGG晶体。吸收光谱分析表明Er∶YSGG晶体在967.5 nm有较强的吸收峰和较宽的吸收谱带。采用966 nm半导体激光器泵浦YSGG/Er∶YSGG复合激光晶体元件,实现了2.796μm的连续激光输出,最大输出功率439 mW,相应的斜率效率为12.5%,光光转换效率为10.6%。

与细胞周期G_2/M期进程相关的H2AX磷酸化

γH2AX焦点(foci)被普遍当做DNA双链断裂(DSB)损伤的分子标志物.为探讨细胞周期进程相关的H2AX磷酸化规律特征,采用胸腺嘧啶双阻滞结合噻氨酯哒唑(nocodazole)的后续处理,将HeLa细胞同步于有丝分裂的前中期.然后,用流式细胞仪检测细胞周期、Western印迹和免疫荧光法,观察γH2AX表达和γH2AX焦点的形成.结果显示,细胞进入G2/M期和有丝分裂过程中,γH2AX水平显著增加;在无DNA DSB发生的情况下,部分M期细胞中也存在大量的γH2AX焦点.随着细胞完成有丝分裂从M期退出再进入G1期,γH2AX的表达水平逐渐降低.这种γH2AX表达变化特征与G2/M期密切关联的PLK1和Cyclin B1的表达规律相类似.在4 Gy大剂量照射下,HeLa细胞于照后8到12 h出现明显的G2/M期阻滞.γH2AX焦点数在照后1 h达高峰,随后降低,照后8 h又上升,出现了第2个峰值.与之不同的是,在1 Gy低剂量照射下,细胞的G2/M期阻滞微弱,γH2AX焦点数在照后0.5 h最高,随后下降,且无反弹,符合DNA DSB的修复动力学特征.因此,将γH2AX当做DNA DSB分子标志物时,还需要考虑细胞周期变化的影响.γH2AX适合作为1 Gy以下照射的DNA双链断裂损伤的分子标志.

三硝基苯磺酸诱导小鼠溃疡性结肠炎模型制备的技术改良

目的:改良2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)硅胶管灌肠诱导制备小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型的方法,提高造模的成功率和模型的稳定性,并探索造模的适宜剂量和时间.方法:选用40只SPF级♂Balb/c小鼠,6-8周龄,随机分为正常对照组、不同浓度TNBS组(37.5mg/kg、75mg/kg、150mg/kg、200mg/k g),每组8只,使用"灌胃针"替代"硅胶管"灌肠,并于灌肠后2d和4d分别处死4只小鼠,观察不同组别小鼠生理状态、结肠组织的损伤及病理学的改变情况.结果:在"灌胃针"造模过程中未发生小鼠死亡现象;对照组小鼠一般情况及结肠黏膜组织无异常改变;小鼠灌肠后出现少食、少动、体质量下降、皮毛光泽度下降、腹泻、便血.不同浓度TNBS造模组随着TNBS剂量的增加,小鼠结肠黏膜组织出现充血、出血、水肿、炎症、溃疡的程度增加.HE染色可见结肠组织水肿、炎症细胞浸润、杯状细胞缺失、溃疡形成的程度逐渐增加.其中TNBS37.5mg/kg、75mg/kg组于造模后2d,以上损伤现象开始缓解,未形成稳定的UC模型;150mg/kg、200mg/kg组持续时间较长,以上损伤现象4d内未见明显缓解,150mg/kg组表现为较典型的UC模型,200mg/kg为重症UC模型.结论:对制造小鼠UC模型进行相关技术改进,使灌肠更加简便,提高造模效率,显著增加了模型的稳定性.