幽门螺杆菌毒力致病因子研究进展

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H pylori)感染是一种世界范围内常见的慢性感染,可致多种疾病,如:慢性胃炎,十二指肠溃疡,胃黏膜相关的淋巴样组织淋巴瘤及胃腺癌.不同疾病是由H pylori和宿主之间复杂的致病机制导致.近年来,学者们对H pylori毒力致病因子的研究取得了长足进展,为揭开H pylori感染的致病机制奠定了基础.本文就H pylori毒力致病因子CagA、VacA、BabA、SabA、OipA、DupA等的最新研究进展进行了综述.

小鼠H pylori长期感染模型研究

目的:用H pylori SSl(Sydney strainl)感染C57BL/6小鼠及Balb/c小鼠,建立稳定的H pylori感染的小鼠实验动物模型. 方法:通过灌胃的方式用H pylori SS1菌株感染二级C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠,灌胃后4、12及24 wk分三次处死动物,用胃黏膜匀浆液进行细菌培养试验、尿素酶试验、胃病理组织学检查以及血清学抗体检测试验. 结果:灌胃4wk后,处死的7只Balb/c小鼠经胃组织细菌培养发现有6只显示阳性结果;处死的7只C57BL/6小鼠中有5只显示阳性结果.12和24wk后的实验组7只Balb/c 小鼠胃组织细菌培养均为阳性,而7只C57BL/6小鼠中有6只显示阳性结果.在不同阶段尿素酶检测的阳性结果与细菌培养法结果一致.实验组动物胃窦部及胃体部均出现了轻度至中度慢性活动性胃炎变化;血清学IgG检查表明,各实验组的实验动物产生了抗H pylori血清抗体;而对照组动物的胃黏膜匀浆液经各项检测均为阴性. 结论:成功地建立了H

EZH2在肝癌发生发展中功能的研究进展

多种因素引起的原癌基因激活和抑癌基因失活是导致肝癌发生发展的主要原因.EZH2是新近发现的具有组蛋白甲基转移酶活性的癌相关基因,主要通过催化H3K27me3修饰介导基因沉默,参与X染色体失活、细胞分化和胚胎发育调节.近来发现,EZH2在多种机制调节下在肝癌组织中过度表达,通过多种机制调控其下游基因异常表达,从而参与肝癌发生发展的多个过程.本文针对以上进行了总结和讨论.

人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆表达及活性鉴定

目的获得高表达人铜锌超氧化物歧化酶(hCu/Zn-SOD)的工程菌。方法采用RT-PCR技术从人胃组织总RNA中分离扩增了hCu/Zn-SOD的cDNA序列,将该基因重组到T7启动子控制下的分泌型表达载体pET22b(+)中,构建了表达质粒pETSOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。采用SDS-PAGE、蛋白质免疫印迹分析其活性。结果该工程菌可高表达一相对分子质量大约16kD的蛋白,与抗人Cu/Zn-SOD多克隆抗体有特异的免疫反应,表达量可达菌体可溶性蛋白的20%以上,且具有特异性SOD酶活性。结论该菌株分泌表达了有天然酶活性的hCu/Zn-SOD,为大量制备hCu/Zn-SOD和下一步研究工作奠定了基础。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和热休克蛋白A亚单位的融合表达

目的将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因和热休克蛋白A亚单位基因融合,并实现其在大肠杆菌中的表达,为构建该菌的基因工程二价苗打下基础.方法通过交叠延伸拼接PCR法将幽门螺杆菌ureB基因和hspA基因通过(Gly4Ser)3linker连接起来,经NcoⅠ和NotⅠ双酶切后定向克隆入表达载体pET22b+的pelB前导序列下游,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL31(DE3),用1PTG诱导表达.结果幽门螺杆菌的尿素酶B亚单位基因和热休克蛋白A亚单位基因通过linker获得了融合,序列分析表明,此融合基因序列拼接正确,且是通读的.含有该融合基因表达载体的表达菌株BL31(pET-BA)在30℃经IPTG诱导表达4h后,用10%SDS-PAGE电泳分析表明,在细菌周质表达有约与预期融合基因表达蛋白大小一致的外源蛋白质表达带.结论幽门螺杆菌ureB与hspA成功地实现了在大肠杆菌中的融合表达,为进一步评价其对Hp的免疫保护效果和构建Hp二价基因工程苗打下了基础.

大肠杆菌表面CS3菌毛展示随机肽库的构建

目的:在肠毒素性大肠杆菌CS3菌毛表面构建 10肽随机肽库．方法:首先将原有的单酶切CS3菌毛呈现载体改造为双酶切载体,并证实改造后的载体能正确形成CS3菌毛．同时设计合成2条寡核苷酸序列,链1含有1个10肽随机编码序列(NNS)10, 链2可与链1的3′端互补．两条链经过退火、延伸、酶切和回收与经过同样酶切的呈现载体连接,连接产物纯化后分多次电击转化,获得随机肽库．随机挑选10个克隆进行测序并对测序结果进行分析．结果:获得1个库容量为1．8×106大小的随机肽库．测序结果显示,所构建肽库的基本框架与预期设计相符,4个寡核苷酸出现的频率也与理论值相接近．结论:在肠毒素性大肠杆菌CS3菌毛表面成功构建库容量为1．8×106大小的10肽随机肽库．为下一步利用肽库进行筛选奠定了基础．

幽门螺杆菌hp0596基因缺失突变体的构建

目的:构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)hp0596基因缺失突变体,为进行hp0596基因功能研究奠定基础.方法:利用PCR技术,从H.pylori 26695基因组分别扩增得到hp0596基因的上游同源臂和下游同源臂,与两端带有FRT位点的氯霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体;以重组载体为模板扩增打靶片段,将其转化入H.pylori 26695;在抗生素选择压力下,打靶片段和菌体基因组发生同源重组,通过氯霉素抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌.结果:构建的突变载体经限制性内切酶酶切分析显示,产生的条带与预计结果完全一致.PCR方法扩增突变株0596,cmr基因显示,0596基因已经被完全敲除,经DNA测序,RNA水平,蛋白质水平证实筛选得到了0596基因缺失的H.pylori26695△0596突变株.连续培养7代后,H.pylori26695△0596突变株具有良好的稳定性.结论:获得了H.pylori26695△0596基因缺失突变体.

表达炭疽保护性抗原的日本脑炎病毒复制型DNA载体的免疫原性研究

目的探讨应用日本脑炎病毒(JEV)复制子pCMW-2M构建炭疽JEV复制子DNA疫苗候选株的可能性。方法实验起止时间:2009年1—5月。将炭疽保护性抗原(PA)基因插入复制子pCMW-2M,构建重组质粒pCMW-2MPA。选取6~8周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠18只,将其随机分为pCMW-2MPA组(6只,注射pCMW-2MPA)、pCMW-2M组(6只,注射pCMW-2M)、PBS组(6只,注射PBS),进行pCMW-2MPA免疫小鼠实验。观察重组Trx-PA在大肠杆菌中的表达和纯化情况,检测pCMW-2MPA在BHK-21细胞中的表达情况,测定各组小鼠第1、2、3次免疫血清抗PA抗体滴度,检测各组小鼠T细胞刺激指数。结果用SalⅠ和Bsp EⅠ酶切鉴定重组质粒pCMW-2MPA,出现2 025bp和12 500bp两个条带。重组Trx-PA分子量约30KD,与预期一致,其中500 mmol/L咪唑洗脱组分目的蛋白含量较高、杂蛋白几乎没有,重组Trx-PA水平约为300ng/ml。pCMW-2MPA在约30%的BHK-21细胞中呈阳性表达,呈现绿色荧光。pCMW-2MPA组、pCMW-2M组、PBS组随着免疫次数的增多,血清抗PA抗体滴度逐步增高(P<0.05)。pCMW-2MPA组、pCMW-2M组、PBS组第1次免疫、第2次免疫、第3次免疫血清抗PA抗体滴度比较,差异有统计学意义(P<0.05)。pCMW-2MPA组、pCMW-2M组、PBS组T细胞刺激指数比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论构建的炭疽JEV复制子pCMW-2MPA以DNA形式免疫小鼠后能够产生特异性体液免疫反应和细胞免疫反应,可作为炭疽JEV复制子DNA疫苗候选株。