LAMP法检测儿童粪便中肠道腺病毒的建立

目的通过应用环介导等温扩增(LAMP)建立一种快速、简便的可视化检测儿童肠道腺病毒核酸的方法。方法登录GenBank网站下载腺病毒40和41基因型的六邻体序列,根据该区段的保守序列设计4条LAMP引物。将反应体系加入EP管,在恒温条件(65℃)扩增60min后,再以凝胶电泳和钙黄绿素染色评价LAMP法的特异性和灵敏度,并和PCR法的结果相比较。最后,同时用LAMP和PCR法对40份可疑临床样本进行检测,应用卡方检验进行统计学分析。结果 LAMP法能准确地使腺病毒40和41型得到扩增,酶切结果也正确,显示了LAMP法较好的特异性。LAMP的灵敏度比PCR高约10倍。经过对40份临床样本的检测,LAMP与PCR均没有发生非特异扩增,LAMP法和PCR法的一致性为92.5%(P>0.05)且LAMP法没有漏检阳性样本。另外,使用钙黄绿素染色的方法更好地显示了产物检测的可视性和简便性。结论该研究初步建立了快速、简便、可视化检测肠道腺病毒的LAMP技术,在基层医疗机构有一定的实用价值。

反转录环介导等温扩增技术对丙型肝炎病毒可视化分型检测

目的应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)可视化检测丙型肝炎病毒(HCV)1b和2a基因型,为RTLAMP技术应用于现场或基层医院提供初步探索经验。方法首先,收集临床阳性样本并用荧光定量PCR分型检测,把样本基本分为1型和非1型。然后分别根据HCV 1b和2a基因型设计RT-LAMP引物并优化反应条件,通过互换模板实验验证这2套引物的特异性,并通过检测稀释的模板以验证引物的灵敏度。同时用钙黄绿素进行产物显色,使HCV分型检测可视化。最后用RT-LAMP方法检测临床样本,并计算阳性率,应用配对卡方检验比较RT-LAMP和荧光定量PCR的统计学差异。结果优化好的RT-LAMP体系的特异性好,对HCV 1b型的检测灵敏度为103 IU/mL,2a型的检测灵敏度为104 IU/mL。另外,利用钙黄绿素进行产物检测的效果和电泳结果相当。通过对临床样本分型检测,HCV 1b型样本的RTLAMP检测结果和荧光定量PCR差异无统计学意义(P>0.05),HCV 2a型样本的RT-LAMP检测结果和荧光定量PCR差异有统计学意义(P<0.05),但是未检出的样本中有2例为HCV 2b型。结论 RT-LAMP对HCV的可视化分型检测具有较好的特异性和灵敏度,操作简便,具有在现场或基层医院的应用前景。

环介导等温扩增技术可视化检测结核分枝杆菌

为了提升对结核分枝杆菌(MTB)检测的实用性,本文开展了采用环介导等温扩增方法(LAMP)对MTB进行可视化检测的研究。首先,根据MTB 16S r DNA序列设计LAMP引物。然后,收集临床痰液样本并进行相应处理。为了评价LAMP的特异度和灵敏度,本文用电泳产物进行检测并用钙黄绿素进行可视化验证。最后,以细菌培养结果为金标准,用SPSS 17.0软件比较培养结果与LAMP的一致性。结果显示,特异度实验中无非特异扩增现象,灵敏度实验中的检测极限为10拷贝。另外,可视化产物检测方法和电泳后的灵敏性相一致。进一步进行临床实用性评价,灵敏性为94.47%,特异性为90%,与细菌培养无统计学差异,结果一致性较好(P>0.05)。综上,LAMP技术高效而可视,具有在设备匮乏的现场和基层医疗机构的应用前景。

环介导等温扩增技术检测新兵腺病毒感染研究

目的建立环介导等温扩增(LAMP)方法,用于腺病毒7、14和55型感染检测。方法针对腺病毒7、14和55型Hexon区段设计4条特异性引物,建立LAMP预反应体系。然后对反应温度和时间进行优化;通过与PCR比较评估该方法的特异性和灵敏度,同时观察使用钙黄绿素染料的检测效果,最后对40例新兵鼻咽分泌物标本进行检测。结果优化的LAMP最适扩增温度为65℃,扩增时间为60min。建立的LAMP方法特异性好,只有腺病毒7、14和55型扩增阳性。LAMP可以使1︰1 000倍稀释的腺病毒DNA得到扩增,其灵敏度比PCR高10倍。同时用LAMP和PCR法对新兵腺病毒感染情况用SPSS软件进行比较,结果LAMP法与PCR法的一致性较差(Kappa=0.562,P<0.05),而与荧光定量PCR(FQ-PCR)一致性较高(Kappa=0.818,P>0.05)。利用染料钙黄绿素进行可视化检测的效果和电泳方法相当。结论 LAMP法检测腺病毒7、14和55型感染优于PCR法,这种新方法也适用于基层医院实验室和流行区。

环介导等温扩增技术在临床检测中的优势与展望

环介导等温扩增技术(LAMP)因其在众多核酸扩增技术中具有灵敏、特异、操作简单等优势,被众多研究者用来扩增各种病原体。本文综述了LAMP技术在临床检测方面的显著优势、几点不足和相应建议,最后对该技术的未来发展进行展望,旨在为该技术在疫区现场和基层医疗机构的推广应用进一步扩宽研究思路。

利用反转录环介导等温扩增技术检测丙型肝炎病毒

鉴于丙型肝炎病毒(HCV)危害着人类健康,本研究拟用反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)建立一种简易检测方法。收集并用FQ-PCR(金标准)检测临床样本。根据HCV保守5'非编码区设计4条通用引物,然后用Taq DNA聚合酶优化传统RT-LAMP体系,通过酶切和交叉实验以评价RT-LAMP的特异性,通过和反转录PCR(RT-PCR)同时检测倍比稀释的模板以评价RT-LAMP的灵敏度。同时判断钙黄绿素和羟基萘芬蓝(HNB)染色法是否与电泳法的结果相同。结果显示,Taq DNA聚合酶可提高扩增效率,RT-LAMP的特异性好,酶切片段与预期相一致(216bp)且只有HCV被扩增,灵敏度为10IU/tube,比RT-PCR高10倍。另外,两种染料和电泳法的检测结果相同。RT-LAMP和RT-PCR检测75例临床样本的一致性差(P<0.05,Kappa=0.375),和FQ-PCR的一致性好(P>0.05,Kappa=0.762)。综上所述,RT-LAMP简易、特异、灵敏,适用于基层医疗机构。

反转录环介导等温扩增技术检测甲型H1N1流感病毒的建立

目的通过应用反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）对甲型H1N1流感病毒进行基因检测，建立一种快速、简便的可视化核酸检测技术。方法先针对甲型H1N1流感病毒HA基因区段，设计2对RT-LAMP引物。通过检测不同病毒评估引物的特异性，通过检测倍比稀释的临床样本确定RT-LAMP的灵敏度。用羟基萘酚蓝（HNB）染料对产物进行可视化检测．同时用凝胶电泳进行结果验证。最后用RT-LAMP检测临床样本，使用卡方检验比较与TaqManPCR的一致性。结果RT-LAMP的引物特异性好，可准确地使甲型H1N1流感病毒扩增。通过对稀释模板的检测，得出RT-LAMP的灵敏度为2．5×10^3拷贝／ml。RT-LAMP扩增结果可通过HNB可视化判定，与凝胶电泳的效果相当。对RT-LAMP和TaqManPCR的显著性差异经统计学评价，可知二者一致性较好（P〉0．05）。结论本研究实现了可视化检测甲型H1N1流感病毒，具有更好的灵敏性，该技术在基层医疗机构有一定的实用价值。

反转录环介导等温扩增技术对丙型肝炎病毒1b和2a基因型检测

利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)对中国主要的丙型肝炎病毒(HCV)1b和2a基因型进行扩增。首先,收集临床采样标本,对其进行定量和定性。第二,分别根据HCV 1b和HCV 2a序列的5’非转录区(5’UTR)设计相应的RT-LAMP引物。第三,利用与非特异模板的交叉反应以评价各引物的特异性,利用内切酶酶切产物以进一步保证扩增准确。第四,利用倍比稀释的模板以评价各引物的灵敏性,并用依赖钙黄绿素/Mn2+的可视化方法与电泳结果比较。最后,利用RT-LAMP对所有采样标本进行HCV 1b和HCV 2a两组平行反应,SPSS统计学软件对其实用性初步评价。结果显示,所设计的RT-LAMP引物特异性好,HCV 1b和HCV 2a型产物大小均与预期相同。最低可检测的模板量为100IU/mL,且可视化染色方法电泳结果相一致。统计学软件比较扩增结果表明RT-LAMP与实时荧光定量PCR之间没有统计学差异(P>0.05)。综上,RT-LAMP设备简单,操作简便,具有在基层医疗机构的应用前景。