人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外区2-3loop在Pichia.pastoris酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的 :研究人Flt 1胞外区 2 3loopcDNA在Pichia pastoris酵母中的表达 ,获得高效表达的具有生物学活性的重组Flt 1(2 3)。方法 :采用PCR扩增Flt 1(2 3)基因 ,经DNA序列分析后 ,插入含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母表达载体中 ,构建重组质粒pPIC9K Flt 1(2 3) ,转化酵母宿主菌GS115 ,筛选His+ Muts 表型转化子 ,摇瓶培养 ,1%甲醇诱导表达。表达产物经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,测定其生物学活性。结果 :SDS PAGE分析显示 ,表达产物以可溶性分子形式存在于上清中 ,诱导 4d的表达量达上清总蛋白的 6 0 %以上。ELISA及Westernblot实验表明 ,表达产物具有良好的抗原性和特异性。经CM SepharoseFF阳离子交换层析和SephacrylS 10 0分子筛层析纯化后 ,Flt 1(2 3)纯度达到 90 %以上。生物学活性检测证实其具有结合hVEGF1 6 5 的能力和抑制hVEGF1 6 5 对HUVEC的促增殖功能。结论 :获得了具有生物学活性的可溶性重组Flt 1受体胞外区 2 3loop小片段 ,为进一步的动物实验和临床应用打下了基础。

VEGF_(165)cDNA在酵母中的表达、纯化及其生物学活性研究

目的研究人 ＶＥＧＦ１６５基因在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中的表达，获得高效表达、具有生物学活性的重组ｈＶＥＧＦ１６５。方法采用ＰＣＲ扩增ｈＶＥＧＦ１６５基因，经ＤＮＡ序列分析后，插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母表达载体中，构建重组质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ｈＶＥＧＦ１６５。经转化酵母宿主菌ＫＭ７１，筛选多拷贝整合转化子，摇瓶培养，用 １０ ｍＬ／Ｌ甲醇诱导表达。表达产物经Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化后，以人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）测定其生物学活性。结果ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，表达产物以可溶性分子的形式存在于上清中，诱导４ｄ的表达量达上清中总蛋白的６０％以上。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ表明，表达产物具有良好的抗原性和特异性。经Ｈｅｐ－ａｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂ亲和层析纯化， ｒｈＶＥＧＦ１６５的纯度可达到９０％以上。生物学活性检测证实，其具有刺激脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）增殖的活性。结论在 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统中，实现了ｈＶＥＧＦ１６５的高效分泌性表达。

重组B7-2腺病毒载体的构建及其诱导小鼠抗肝癌免疫的初步研究

探讨重组腺病毒介导的Ｂ７２基因转染对小鼠肝癌细胞免疫原性的影响。构建Ｂ７２的重组腺病毒载体，通过重组腺病毒介导，将Ｂ７２和ｌａｃＺ基因分别转染小鼠肝癌细胞Ｈｅｐａ１６，并在不同时相检测Ｂ７２和ｌａｃＺ基因的表达水平，建立小鼠肝癌肿瘤模型，在小鼠体内观察Ｂ７２基因转染对小鼠肝癌免疫原性的影响。成功地构建了Ｂ７２的重组腺病毒载体，用Ｂ７２及ｌａｃＺ重组腺病毒分别转染小鼠肝癌细胞，转染后４ｈ开始检测到Ｂ７２或ｌａｃＺ表达，其表达量逐渐升高至４８～７２ｈ达高峰后逐渐降低。经２次／ｗ肿瘤内注射，共５次Ｂ７２治疗后，肝癌体积明显缩小，与对照生理盐水组及ｌａｃＺ组相比，有显著差异。小鼠肝癌组织中Ｂ７２的表达能增强其免疫原性，减少其致瘤性。

论机遇在科学研究中的重要作用——tk基因/GCV对肿瘤细胞体外杀伤机制新假设的形成与验证

论机遇在科学研究中的重要作用———ｔｋ基因／ＧＣＶ对肿瘤细胞体外杀伤机制新假设的形成与验证第一军医大学分子生物学研究所（广州５１０５１５）吴小兵第一军医大学分子免疫学研究所（广州５１０５１５）董小岩笔者从１９９４年初开始从事“逆转录病毒介导的ＨｙＴＫ...

rhIL-2/GM-CSF融合蛋白抗体制备、鉴定及其生物学活性研究

目的 :制备 rh IL - 2 / GM- CSF融合蛋白的抗体 ,并观察该抗体的特异性及对融合蛋白生物学活性的影响。方法 :用纯化的融合蛋白 (rh IL - 2 / GM- CSF)作为抗原 ,免疫新西兰兔后制备抗血清 ,用 EL ISA和 Dot- EL ISA检测抗体滴度和特异性。用依赖株细胞增殖实验检测抗体对 rh IL - 2 / GM- CSF生物学活性的影响。 结果 :此抗体效价高 ,特异性好 ,不仅与融合蛋白(rh IL - 2 / GM- CSF)、IL - 2以及 GM- CSF发生反应 ,而且能够竞争抑制 rh IL - 2 / GM- CSF的生物学活性。 结论 :此抗体可用于融合蛋白 (rh IL - 2 / GM- CSF)

腺病毒B7-1治疗小鼠肝癌及其免疫机理的初步研究

为了探讨肿瘤原位转染共刺激分子Ｂ７－１对小鼠肝癌的治疗作用及其机理，本文在建立了小鼠肝癌模型的基础上，采用表达小鼠Ｂ７－１的重组腺病毒直接瘤体内注射，结果可显著抑制小鼠肝癌的生长，明显延长荷瘤小鼠的存活期。肝癌组织ＨＥ染色及免疫组织化学分析发现，经重组腺病毒ｍＢ７－１治疗的肿瘤内大片组织坏死出血，坏死组织与未坏死组织交界处有大量淋巴细胞浸润，浸润淋巴细胞表现为ＣＤ３＋，ＣＤ８＋，ＦａｓＬ＋和ｐｅｒｆｏｒｉｎ＋。ＲＴ－ＰＣＲ显示，ＦａｓＬ和穿孔素ｍＲＮＡ表达呈阳性。

口服免疫耐受研究的新进展

口服免疫耐受是诱导外周免疫耐受的重要方法。口服抗原诱导免疫耐受的主要机制是主动抑制和克隆失活，低剂量口服抗原通过主动抑制起作用，而高剂量抗原主要是诱导克隆失活。口服自力抗原以疾病和抗原特异性方式抑制了几种实验性自身免疫动物模型，如实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（ＥＡＥ）、眼葡萄膜炎、肌无力、胶原和佐剂诱导的关节炎、ＮＯＤ小鼠的糖尿病等；此外，口服自身抗原还可抑制同种异体排斥反应，延长移植物的存活期。在多发性硬化、类风湿性关节支、眼葡萄膜炎等疾病中口服耐受已进入初期临床试验，取得了一定的临床效果，并且未出现明显的毒性作用。

病毒性疾病的免疫基因治疗研究进展

病毒性疾病尤其是慢性病毒性感染，严重危害人们的生命和健康，甚至诱发恶性肿瘤。对病毒性疾病，目前尚无特效药物。免疫治疗和基因治疗技术的出现，为ＨＢＶ、ＨＩＶ等难治性病毒感染的治疗提供了新的途径。

产植酸酶青霉菌株的分离及其生物学特性的初步研究

从霉变的菜籽粕中筛选出具有产生植酸酶、降解植酸能力的青霉菌株P7。在液态发酵条件下，48h植酸降解率达96％。采用DEAE－52柱层析技术部分纯化植酸酶，对其生物学特征的研究表明：该植酸酶的最适反应温度为60℃，最适反应酸碱度为pH5.0，测得酶的米氏常数为0．25mmol／L。

粒细胞集落刺激因子的免疫学测定方法的建立

由于hG-GF的重要作用以及rhG-CSF在临床上的广泛使用，有必要进一步了解正常人和某些疾病状态下病人外周血循环中G—CSF的浓度。利用两株针对不同抗原决定簇的单克隆抗体，建立了双抗夹心ELISA方法。方法特异性较好，检测灵敏度为340pg／ml。用该法检测了12例细菌感染病人，有11例病人G—GF检测阳性，阳性率91．6％；白血病病人血清G—GF阳性率25％～35．7％，正常血清则均为阴性。该方法克服了以往骨髓细胞集落形成法和G—GF依赖株测定法需时长、操作繁琐的缺点，为研究正常人和某些疾病状态下病人外周血G—CSF浓度的变化和G—CSF的药代动力学提供了一个简便、快速、特异性高的方法。

雷公藤内酯醇抗移植排斥反应的研究

应用小鼠同种异位心肌移植模型,证实雷公藤内酯醇(triptolide,Tri)可明显延长移植心的存活期。对T淋巴细胞增殖活性影响的实验结果表明,Tri对ConA激活的淋巴细胞转化及特异性抗原激活的混合淋巴细胞反应均有明显地抑制作用;同时,Tri对ConA诱导的IL2产生无影响,但对IL2受体的表达有明显地抑制作用。

BALB/C小鼠对不同佐剂SARS灭活疫苗的早期免疫反应

目的 :研究含不同佐剂的SARS灭活疫苗免疫小鼠后 ,小鼠的早期细胞免疫和体液免疫反应。方法 :灭活的SARS冠状病毒F6 9株分别与弗氏佐剂、氢氧化铝、CpG佐剂配伍 ,制备灭活疫苗。接种 6周龄SPF级BALB C小鼠。定时采血 ,分析小鼠外周血中CD4 + 、CD8+ T细胞亚群动态变化 ,同时测定鼠血清中特异性IgG抗体及抗体的病毒中和活性。结果 :由3种佐剂制备的SARS灭活疫苗免疫小鼠后 ,CD4 + 、CD8+ T细胞百分比升高或无明显改变 ,CD4 CD8比值无显著性改变。其中 ,弗氏佐剂疫苗免疫小鼠的CD4 + T细胞百分比升高较明显 ,且在一段时间内 ,维持在一个较高的水平 ;铝佐剂疫苗免疫小鼠后 ,未观察到明显T细胞亚群改变 ;而CpG佐剂疫苗免疫小鼠的CD8+ T细胞百分比改变较其它佐剂疫苗改变更明显。与此相异的是 ,3种疫苗均可诱导小鼠产生较高滴度特异性IgG抗体 ,并且所产生的抗体具有中和活性。在初免后第 34天 ,3种佐剂组的IgG抗体滴度分别为 1∶1 2 80 0、1∶32 0 0和 1∶1 6 0 0 ,中和效价分别为 1∶2 5 6 0、1∶96 0和 1∶32 0。结论 :SARS灭活疫苗接种小鼠后 ,可诱导较强的体液免疫反应 ,同时轻度上调CD4 + 、CD8+ T细胞活性 ,程度因佐剂而异。

以粘粒为基础产生重组单纯疱疹病毒HSV1-lacZ的研究

将总长度为１５２ｋｂ的单纯疱疹病毒１型（ＨＳＶ－１）（１７株）基因组分成５个相互间有部分重叠的大片段（约３５－４０ｋｂ），分别克隆到粘粒ＳｕｐｅｒＣｏｓＭＷ中，依次称为ｃｏｓ４８、ｃｏｓ２８、ｃｏｓ６、ｃｏｓ１４和ｃｏｓ５６（ＤａｖｉｓｏｎＡＪｅｔａｌ，１９９３）。此５个粘粒用ＰａｃⅠ切去粘粒骨架后共转染细胞，可发生同源重组而产生野生型ＨＳＶ－１。以此为基础，利用粘粒ｃｏｓ５６的ＨＳＶ－１ＵＬ４４基因中含有一个ＸｂａⅠ单一酶切位点的特点，将一个两端加有ＸｂａⅠ位点的ＣＭＶ－ｌａｃＺ－ｐｏｌｙＡ片段插入其中，构建成ｃｏｓ５６－ｌａｃＺ。将ｃｏｓ５６－ｌａｃＺ与其它４个粘粒经ＰａｃⅠ酶切后，用ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ转染试剂共转染ＢＨＫ－２１细胞，３７℃培养２－３天，开始出现细胞病变及噬斑。５天后将病变细胞连同培养液一起冻融３次，取上清０．１ｍｌ感染新鲜的ＢＨＫ－２１细胞，３７℃培养２４小时，用Ｘ－ｇａｌ染色３０－６０分钟，镜下观察可见大量蓝色噬斑。蓝色噬斑数占噬斑总数的５０％以上。经空斑纯化的蓝斑病毒可稳定传代。这种方法同将外源基因表达盒插入ＨＳＶｔｋ基因中构建成重组质粒，再与ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ共转染细?

人粒细胞集落刺激因子包涵体的提取及其复性研究

研究人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）包涵体的复性方法。方法：采用我室发明的包涵体提纯新方法。结果：复性回收率可达９０％以上，生物活性达天然比活的８０％以上。结论：对ｒｈＧ－ＣＳ Ｆ包涵体提纯和复性的研究，建立了ｒｈＧ－ＣＳＦ的复性新方法。

重组人粒细胞集落刺激因子生产质量控制方法的研究

利用凝胶图像光密度分析系统和高效液相色谱双向综合检测方法对重组人粒细胞集落刺激因子的生产及纯化过程进行质量跟踪监控，使目标产品含量控制在＞98％；产品批间差异＜0.15，保证了纯化质量。

大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子工程菌DH5α的发酵工艺研究

研究大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激；因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）工程菌ＤＨ５α的发酵工艺。方法：采用发酵罐发酵，对影响工程菌生长和目标蛋白的表达条件如：工程菌发酵的培养基配方、ｐＨ值、诱导时间、分批补加营养物质等进行了优化。结果：根据优化的条件，２０Ｌ罐发酵工程菌，菌体收得量可达湿重１５．６ｇ／Ｌ。目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的３０％。结论：此发酵工艺可以提高ｒｈＧ－ＣＳＦ工程菌菌体的得率和目标蛋白的表达。

IL-2-PE40、CsA、雷公藤治疗角膜移植排斥反应实验研究

目的采用ＩＬ２ＰＥ４０、ＣｓＡ、雷公藤对角膜移植排斥反应进行实验性治疗。方法以Ｗｉｓｔａｒ大鼠异种角膜异位移植为模型，比较ＩＬ２ＰＥ４０、ＣｓＡ、雷公藤的免疫抑制疗效，同时测外周血Ｔ淋巴细胞亚群及Ｔ淋巴细胞集落形成数。结果ＩＬ２ＰＥ４０、ＣｓＡ、雷公藤均可推迟排斥反应的发生时间。ＩＬ２ＰＥ４０能明显减弱Ｔ淋巴细胞集落形成能力，Ｔ细胞集落数术前为２０１±１８．９，术后第５天为２１３±１９．４，而ＣｓＡ、雷公藤无该方面作用。结论ＩＬ２ＰＥ４０较ＣｓＡ、雷公藤特异性高，且提示有可能在更高层次上抑制排斥反应的发生。

微柱高效液相色谱分析基因工程药物rhG-CSF肽谱的应用研究

用二硫代苏糖醇还原基因工程药物产品中的二硫键，并用碘乙酰胺封闭巯基，再用胰蛋白酶裂解，经微柱高效液相色谱分离分析rhG－CSF产品的肽谱，3个批号批间结果完全一致。该方法具有系统操作误差小，用样品量少，较常现高效液相色谱检测灵敏度高，重视性好的优点。是适用于基因工程药物产品肽谱分析，衡量产品生产纯化工艺稳定性比较优秀的方法之一。

角质细胞生长因子-2的发酵及纯化工艺研究

目的研究重组人角质细胞生长因子 2 (rhKGF 2 )工程菌的高密度发酵和提纯工艺。方法通过增加培养基营养成分 ,发酵过程补加葡萄糖 ,获得高产率菌体。细菌裂解液经硫酸铵沉淀、分子筛、肝素亲和色谱和离子交换色谱等方法进行纯化 ,电泳分析结果。结果每 1L发酵液可获得菌体 12 .2g ,表达率达 2 8.7%。纯化后rhKGF 2纯度达 97%。结论rhKGF 2工程菌可获得高密度发酵。纯化工艺适用于rhKGF