聚合酶链式反应检测结核杆菌的研究

以人型结核杆菌基因组 DNA 为模板,合成二段引物各20个碱基进行聚合酶链式反应(PCR)。经琼脂糖凝胶电泳证实,获得一条245bp 扩增带。PCR 检测的敏感性染色体基因组DNA 为1pg,菌悬液为13个活菌/ml。在特异性试验中,人型结核杆菌、牛型结核杆菌、BCG可见此扩增带。被试的其它14种抗酸菌以及变铅青链霉菌、大肠杆菌质粒 PUC19、星状诺卡氏菌、红球菌均未见该扩增带。54例肺结核痰标本3种方法检查的阳性率分别为:萋尼氏抗酸染色16.7%,培养法14.8%,PCR 37.0%。前2种检查方法分别与 PCR 比较,经统计学处理均有显著性差异(P<0.01)。12例非结核性肺部疾患痰标本抗酸染色和 PCR 均为阴性。结果表明,PCR 技术是快速、敏感、特异诊断结核病的方法。

结核杆菌分泌蛋白katG基因的克隆、表达及其诊断价值

目的 获得重组katG(简称rkatG)蛋白 ,研究其免疫学特性 ,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法 应用基因工程技术表达、纯化katG蛋白 ,通过Westernblotting分析其抗原性 ,分别以结核分支杆菌PPD或纯化的rkatG蛋白为抗原 ,通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果 重组质粒pET2 4b -katG在大肠杆菌BL2 1 (DE3)细胞内以包涵体形式表达 ,表达量占菌体总蛋白的 2 8 2 %～ 56 3 %左右 ,分子质量约为80 0 0 0 ,Westernblotting分析与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rkatG样品经SDS -PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为 92 75 %,每 1 0 0ml培养菌可获得 2 8mg左右的重组蛋白。以 33例正常人血清的OD值 +2s为正常界限值 ,一步法的特异性和敏感性分别为 87 9%(2 9/ 33) ,65 6 %(2 1 / 32 ) ;PPD分别为93 9%(31 / 33) ,62 5 %(2 0 / 32 ) ;rkatG分别为 97 0 %(32 / 33) ,1 5 2 %(5/ 33)。结论 pET2 4b -katG大肠杆菌工程菌能以包涵体形式表达rkatG蛋白 ,该蛋白具有较高的抗原特异性 ,但检测抗结核抗体的灵敏度低。

结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H3 7Rv基因组为模板 ,PCR扩增Ag85A编码基因 ,用限制性内切酶消化后 ,插入真核表达载体pVAX1中 ,转化大肠杆菌DH5α ,进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌H3 7Rv基因组为模板 ,用Ag85A引物PCR扩增出 10 41bp特异性片段 ,以重组子DNA为模板用Ag85A引物PCR扩增为阳性 ,重组子经限制性内切酶消化后可见目的片段 ,所测定序列与报道的Ag85A序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株 ,该DNA疫苗的免疫效果有待进一步研究。