无毒性产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸,经人工合成,获得基因片段GETX_(m2)。将GETX_(m2)克隆至原核表达载体p ET30a-(+)后,将p ET30a-GETX_(m2)转化至BL21(DE3)感受态细胞中,在15℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4 h,超声破碎后收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白r ETX_(m2)。利用Western blot方法,检测r ETX_(m2)与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性。将r ETX_(m2)用细胞维持液稀释至100及10μg·m L^(-1),检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)的毒力。分别用胰酶活化前和活化后的r ETX_(m2),以0.0625、0.625和6.25 mg·kg^(-1) 3个剂量尾静脉注射,检测r ETX_(m2)对小鼠的毒力。随后,将r ETX_(m2)与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,取4只健康家兔,皮下免疫2次(间隔两周),100μg/只。同时,Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组。分别在一免后14 d以及二免后21 d,采血,分离血清,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。同时,在二免后21 d,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,检测r ETX_(m2)对家兔的免疫保护效果。【结果】在15℃和37℃条件,r ETX_(m2)在BL21(DE3)菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达,综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间,选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性r ETX_(m2)。灰度扫描结果显示,在37℃诱导条件下,r ETX_(m2)可溶表达比例达30%;Western blot检测结果表明,D型产气荚膜梭菌毒素抗血清能够特异性的识别r ETX_(m2),出现特异性反应条带。MDCK细胞毒性实验显示,在r ETX_(m2)浓度为100μg·m L^(-1)的细胞培养基中孵育24 h后,细胞未出现细胞病变,而2 000倍稀释的D型产气荚膜梭菌天然毒素细胞培养基孵育组的细胞出现了明显的细胞病变;小鼠安全试验显示,尾静脉注射6.25 mg·kg^(-1)剂量的r ETX_(m2),对小鼠无致死性;血清中和试验结果显示,r ETX_(m2)免疫组每毫升的一免兔抗血清可中和450—750个小鼠MLD,每毫升的二免兔抗血清可中和2 500—4 000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,而对照组的兔抗血清对D型产气荚膜梭菌毒素无中和作用;用1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。【结论】产气荚膜梭菌r ETX_(m2)毒力基本丧失,但保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。