伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因的克隆

目的 探讨克隆伴放线放线杆菌菌毛融合蛋白基因ltb_fap的方法。方法 采用PCR方法扩增伴放线放 线杆菌菌毛相关蛋白(Fap)和大肠杆菌不耐热性肠毒素B亚单位(Ltb)的融合蛋白基因ltb_fap,NcoⅠ EcoRⅠ双酶切 载体pET28a(+)及ltb_fap基因,连接形成重组质粒pETltb_fap,转化至大肠杆菌DH5α,扩增后提取质粒pETltb_fap进 行PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果 本实验扩增的ltb基因约为303bp,fap基因约为228bp,融合基因约为 531bp。重组质粒含外源基因片段约为531bp,酶切鉴定可得到一条约531bp带,DNA测序结果表明与GenBank中 的fap基因序列有97.4%的同源性。结论 成功克隆出融合蛋白基因ltb_fap,为进一步进行蛋白表达、制备抗体奠 定基础。

放线共生放线杆菌菌毛重组蛋白的提取及纯化

目的:对大肠杆菌表达的放线共生放线杆菌菌毛重组蛋白LTB-FAP进行提取和纯化,为其用于牙周病的治疗提供理论依据。方法:将重组质粒pET28a/LTB和pET28a/LTB-FAP分别转化到大肠杆菌中进行表达,通过超声裂解法获得以包涵体形式表达的重组外源蛋白LTB-FAP;用2,4,6和8mol·L-1尿素缓冲液对重组蛋白进行洗涤、溶解;然后用阴离子交换和凝胶过滤柱层析对重组蛋白进行纯化,采用薄层扫描仪对蛋白纯度进行测定。结果:目的包涵体蛋白经过3次4mol·L-1尿素洗涤,6mol·L-1尿素溶解后,经薄层扫描可获得纯度为60%的目的蛋白;经离子交换层析纯化,蛋白纯度可达约75%;Sepharose 6B行凝胶过滤层析获得了纯度可达90%的重组蛋白LTB-FAP。结论:阴离子交换和凝胶过滤柱层析的方法可提取、纯化重组蛋白LTB-FAP,获得的LTB-FAP可以用于免疫机体。