致雏鹅痛风相关病原的分子检测

2021年3月,江西省某养鹅场免疫过雏鹅痛风和小鹅瘟卵黄抗体的雏鹅发生痛风,为分析其原因,本试验取9只7日龄病死鹅,剖检观察大体病变;采集所有病例的肝脏样品,分别用星状病毒通用RT-PCR和水禽细小病毒通用PCR进行扩增,对所有扩增产物进行测序和序列分析。剖检结果显示,所有病例均有典型内脏和关节尿酸盐沉积。检测结果显示,所有肝脏样品均为鹅星状病毒(GoAstV)和鹅细小病毒(GPV)阳性。序列同源性分析与遗传演化分析结果显示,所测星状病毒和细小病毒分别属于GoAstV基因2型(GoAstV-2)和GPV 2.2分支。结果表明,该养鹅场的病例均存在GoAstV-2和2.2分支GPV混合感染。

2株J亚群禽白血病病毒毒株的分离鉴定及全基因组序列分析

为了解我国J亚群禽白血病病毒(ALV)的流行特点和进化趋势,本试验从河北某鸡场疑似禽白血病的临床发病鸡的病料组织中,分离得到2株ALV-J毒株,分别命名为CAU2019和CAU2020。通过聚合酶链式反应(PCR)技术分段扩增分离株的全病毒基因组,连接pEASY-Blunt Zero载体后进行序列测定,并对获得的基因组序列与ALV各亚群毒株序列进行序列比对及遗传进化分析。结果表明,2个分离株与ALV各亚群毒株的gag和pol段基因相对保守,而LTR、gp85及gp37段基因变异较大。此外,CAU2019在3′UTR处有2段长度为30 bp和11 bp的不连续的碱基缺失,CAU2020在3′UTR处有1段长度为29 bp的碱基缺失。由gp85和LTR基因构建的遗传进化树可知,2个分离株在遗传关系上与J亚群毒株JS16JH9亲缘关系最近。结果表明本试验分离的2株病毒均为J亚群禽白血病病毒毒株,并且为国内ALV-J流行株的突变株。

巨型住肉孢子虫烯醇酶基因克隆与表达

巨型住肉孢子虫(Sarcocystis gigantea)是羊体内一种常见寄生虫,多寄生于羊横纹肌内形成包囊,导致羊肉大量废弃,给畜牧业带来巨大经济损失。本研究尝试筛选能有效诊断住肉孢子虫感染的抗原。通过免疫印迹及质谱分析筛选到巨型住肉孢子虫候选诊断抗原烯醇酶,利用染色体步移技术扩增两侧翼未知序列并表达重组蛋白。应用生物信息学分析和免疫印迹对该蛋白诊断价值进行评价。结果筛选到的候选蛋白为巨型住肉孢子虫烯醇酶(SgENO),克隆得到1 181 bp的基因并获得重组蛋白rSgENO。对rSgENO应用进行初步评价,发现其与其他顶复亚门原虫的烯醇酶氨基酸相似性均较高(71%～92.1%),且能被弓形虫和新孢子虫阳性血清所识别,具有交叉反应性。本研究克隆并表达了巨型住肉孢子虫烯醇酶,后期评价发现该重组蛋白与新孢子虫和弓形虫有较强的交叉反应性,不能用于羊住肉孢子虫的血清学诊断,但有成为疫苗候选分子的潜力。

猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30株CHsx1401感染性克隆的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响全球养猪业的一种重要病原。近年来,国内新出现的类NADC30毒株导致临床PRRS疫情再次出现。本研究旨在构建PRRSV类NADC30毒株CHsx1401的感染性克隆,以期为研究该类毒株遗传变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制奠定基础。将类NADC30毒株CHsx1401全长基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,分别将扩增片段克隆到pJET1.2载体构建中间质粒,将4个克隆依次连接并克隆到改造后的低拷贝质粒载体pWSK29中,构建全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,并在全长cDNA克隆的C与D片段之间通过同义突变(T11582G)引入AscⅠ酶切位点,作为遗传标记,用于区分拯救病毒与亲本病毒。采用脂质体LTX将全长cDNA克隆质粒转染至MARC-145细胞拯救病毒。结果表明,成功构建出全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,转染MARC-145细胞后传至第二代可观察到明显的细胞病变(CPE)。经间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定鉴定结果表明,从全长cDNA克隆可拯救出病毒。拯救病毒(RvCHsx1401)在MARC-145细胞上可稳定传代,增殖动态与亲本病毒相似,在MARC-145细胞上各时相的病毒滴度略低于亲本病毒。本研究构建的类NADC30毒株CHsx1401的全长cDNA克隆具有感染性,可拯救出病毒;拯救病毒与亲本病毒的体外增殖特性相似,为研究该毒株的变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制提供了技术平台。

副鸡禽杆菌引起蛋鸡肿头病例的诊治

近年来,随着我国家禽养殖业集约化、规模化发展,鸡多病因呼吸道疾病成为冬春寒冷季节的常发疾病[1]。该类疾病的主要临床表现为病鸡呼吸困难、气管啰音,生长发育受阻,产蛋率降低;主要病理变化为鼻窦分泌物增多,喉头、气管黏膜充血、出血,肺脏淤血、水肿,气囊炎,兼有其他内脏器官病变。该类疾病的发生与应激因素刺激有关,诱发病毒、细菌、支原体等病原体混合感染。引起鸡多病因呼吸道疾病的病原主要包括禽流感病毒、新城疫病毒、禽偏肺病毒、传染性支气管炎病毒、鸡毒支原体、副鸡禽杆菌和巴氏杆菌[2]。上述病原感染引起临床症状的相似性,给疾病的确诊带来困难,且不利于快速制定针对性治疗方案。现以一起由副鸡禽杆菌引起的蛋鸡肿头病例的诊断为例,为鸡多病因呼吸道疾病的鉴别诊断提供参考。

免疫雏鹅发生小鹅瘟的原因分析

2018年6月,安徽某鹅场接种过小鹅瘟蛋黄抗体的2批雏鹅发生小鹅瘟,再次用小鹅瘟蛋黄抗体产品进行紧急接种,有一定的控制效果,但仍有雏鹅死亡。为分析其原因,采集了8只9-12日龄病死鹅的肝脏和脾脏,用PCR扩增检测水禽细小病毒的VP3基因,选8份阳性样品测定了鹅细小病毒(GPV)VP1部分序列并进行了序列分析。结果显示,16份组织样品均为阳性。在443 nt VP1区,所测8株病毒之间的序列同源性为100%,与GPV亚洲强毒分支之间的序列同源性为99%。随后,用琼脂扩散沉淀试验分析了2株待检毒株与GPV参考毒株的抗原相关性,并测定了2种小鹅瘟蛋黄抗体产品的效价。结果显示,待检毒株与参考毒株具有相同的沉淀抗原,2种小鹅瘟蛋黄抗体产品的效价分别为1∶2和1∶16。表明免疫雏鹅仍发生小鹅瘟的原因并非源自GPV变异,而是与某些蛋黄抗体产品的抗体效价较低有关。

疑似A型猪内源性逆转录病毒致肿瘤病例

2018年1月,河北某猪场57日龄左右仔猪群出现批量死亡,个别表现神经症状。猪场曾进行过猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒及沙门菌的常规疫苗免疫。在病死仔猪剖检过程中,发现1头仔猪的胸、腹腔内,尤其是。肾脏、脊柱两侧,布满了大量、大小不等的白色肿瘤结节。该仔猪肺脏、肾脏、腹股沟淋巴结中PRRSV、CSFV、PRV等病原的核酸检测结果均为阴性。我们对该病例进行了进一步的病原检测,现报告如下。

鹦鹉喙羽症(PBFD)研究进展

鹦鹉喙羽症(Psittaeine beak and feather disease,PBFD)是由鹦鹉喙羽症病毒引起的一种全球性分布的高度传染性鸟类疫病,严重威胁着野生和宠物鹦鹉,尤其是濒危种属鹦鹉的生存与健康。

与PRRSV nsp11互作的宿主细胞蛋白鉴定及生物信息学分析

【目的】研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp11与宿主细胞蛋白之间的相互作用,对于揭示nsp11在病毒复制过程中发挥的功能至关重要。【方法】在病毒感染细胞的基础上,利用nsp11的单克隆抗体,采用免疫沉淀结合串联质谱的方法,筛选与PRRSV nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,并对所筛选出的宿主细胞蛋白进行了GO注释、COG注释和KEGG代谢通路注释;选取筛选出的宿主细胞蛋白IRAK1,利用免疫共沉淀技术和激光共聚焦技术鉴定其与nsp11之间的相互作用。【结果】与空白对照组相比,病毒感染组中出现3条差异带;经质谱分析共筛选得到了201个与nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,分别与蛋白质代谢、细胞信号通路转导以及病原致病性等密切相关;在生物信息学分析的基础上,实验验证了nsp11确与宿主细胞蛋白IRAK1进行相互作用。【结论】鉴定出与PRRSV nsp11相互作用的宿主细胞蛋白,生物信息学分析显示它们在病毒的复制和致病过程中发挥重要作用。研究结果为探究nsp11的生物学功能指明了方向,也为研究宿主细胞蛋白与病毒蛋白间的相互作用及其调控病毒复制和致病性的分子机制奠定了基础。

鸡源CD40L基因克隆、蛋白表达及生物活性检测

为获得鸡源CD40L(chCD40L)蛋白,以鸡脾细胞制备cDNA并以之为模板扩增chCD40L基因,构建pFastBac-chCD40L供体重组质粒,转化感受态细胞DH10Bac,通过筛选及鉴定获得Bacmid-chCD40L重组质粒,转入真核表达系统sf9昆虫细胞进行蛋白表达与纯化,获得His-chCD40L蛋白。此外,构建pQM01-chCD40L质粒,转染HEK293T细胞进行蛋白表达与纯化,获得Strep-chCD40L蛋白。亲和层析纯化的chCD40L蛋白浓度为0.01 mg/mL。为检测chCD40L蛋白的生物活性,分离和培养3周龄SPF雏鸡的法氏囊组织原代细胞,将chCD40L加入细胞培养液刺激细胞增殖,通过Western blotting试验、间接免疫荧光试验、流式细胞术检测,发现该蛋白能够与法氏囊B淋巴细胞表面的CD40结合,说明chCD40L具有生物活性。成功获得chCD40L蛋白,为原代B淋巴细胞体外培养及IBDV野毒分离与诊断奠定了基础。

鸡Foxp3结构预测及组织表达谱分析

本研究旨在克隆鸡foxp3(chfoxp3)基因全长编码区序列(coding sequence,CDS),并对其进行生物信息学及组织表达谱分析。以50日龄无特定病原鸡为样本,从脾脏组织中克隆chfoxp3基因全长CDS序列,利用在线工具和软件对chFoxp3进行生物信息学分析,以实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测chfoxp3基因在鸡各组织中的表达分布情况。研究结果表明,chfoxp3基因包含882 bp的开放阅读框,编码293个氨基酸,chFoxp3分子质量为33.44 kDa,属于亲水蛋白;chFoxp3具有Fox转录因子家族典型的forkhead结构域,含有核定位信号;其二级结构由α-螺旋(29.35%)、延伸链(10.92%)、β-转角(5.12%)和无规则卷曲(54.61%)组成;chfoxp3在不同组织中表达有差异,在鸡心脏及胰腺中表达水平较高,显著高于脾脏、法氏囊以及胸腺等免疫器官(P<0.01),这一特点明显区别于哺乳动物;通过系统进化树分析发现,鸡Foxp3与其他野禽属于相同分支,但与哺乳动物相差较远。这些研究结果为进一步深入研究chFoxp3的免疫调节功能奠定了基础。

PIAS1对PRRSV N蛋白SUMO化修饰及病毒复制的影响

【目的】猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种危害全球养猪业的重要病原。SUMO(Small ubiquitin-like modifier)化修饰作为一种可逆的翻译后修饰在调节病毒复制方面发挥着重要功能。PIAS1(Protein inhibitor of activated STAT1)是SUMO E3连接酶PIAS家族的一员,可以促进靶蛋白的SUMO化修饰,进而影响靶蛋白的功能,参与基因转录调控过程。探究PIAS1与PRRSV N蛋白相互作用的机制及其对N蛋白SUMO化修饰和病毒复制的影响,为进一步阐明PRRSV复制调控和致病的分子机制提供科学依据。【方法】利用酵母回复杂交、免疫共沉淀和激光共聚焦技术验证N蛋白与PIAS1的相互作用;以递增剂量外源性转染PIAS1观察其是否介导N蛋白SUMO化修饰;采用RNA干扰和慢病毒转导技术测定PIAS1对PRRSV复制的影响。【结果】PIAS1能与N蛋白相互作用,而且两者主要共定位于胞浆中;外源转染PIAS1并未增加N蛋白SUMO化修饰水平;在MARC-145细胞中,PIAS1的表达有利于PRRSV的复制。【结论】PIAS1可促进PRRSV的复制。