液相色谱-高分辨质谱在兽药残留分析中的应用进展

液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)技术在兽药残留分析领域的研究已经显示出巨大的发展潜力。本文阐述了LC-HRMS技术的特点,并总结了近几年来LC-HRMS在兽药多残留筛选分析中的应用实例,展望了LC-HRMS技术的发展前景。应用高分辨质谱的全扫描和精确质量测定功能,结合超高效液相色谱技术,优化样品前处理方法,可以实现100多种兽药残留的同时检测。与四极杆质谱相比,高分辨质谱的参数设定简单,并适用于非定向和未知化合物的筛选,需要增加目标化合物时,不必再次处理样品和进样,重新分析已有的全扫描数据即可。UHPLC-HRMS作为最有潜力的分析技术,仍有很大的发展空间,TOF的分辨率和Orbitrap的扫描速度有待提高,简便易用的数据处理软件也需要完善。

液相色谱-电喷雾串联质谱法检测鸡组织中5种聚醚类药物残留

建立了鸡组织中聚醚类药物多残留检测的高效液相色谱-电喷雾串联质谱方法。采用甲醇提取鸡组织中的拉沙洛菌素、盐霉素、莫能菌素、甲基盐霉素和马杜霉素,经硅胶柱净化,以乙腈(含0.1%甲酸)-0.1%甲酸水溶液(体积比为97∶3)为流动相,Symmetry Shield RP18作为色谱分析柱,多反应监测(MRM)正离子扫描方式进行质谱检测。当5种聚醚类药物的添加水平为鸡肉0.1～1 500μg/kg、鸡肝0.2～4 500μg/kg时,平均回收率为71.6%～99.1%,日内测定的相对标准偏差(RSD)(n=5)为3.2%～10.7%,日间RSD(n=3)为4.6%～14.7%。2种鸡组织中5种聚醚类药物的定量限为0.1～1.0μg/kg。该方法的灵敏度、准确度和精密度均符合兽药残留分析技术的要求,适用于鸡肉和鸡肝中5种聚醚类药物的多残留检测。

牛皮下注射爱普菌素注射剂后组织残留休药期的建立

建立牛肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织中爱普菌素残留的高效液相色谱荧光检测方法（HPLC-FLD）,并用统计学方法计算牛皮下注射爱普菌素后组织残留的休药期。牛组织样品经乙腈提取,过碱性SPE柱。组织样品添加浓度为2～100 ng·g^-1,平均回收率为70.5%～91.2%,变异系数为2.3%～11.5%;方法检测限和定量限分别为1和2 ng·g^-1。18头牛颈部皮下一次性注射爱普菌素注射液（1%）,注射剂量为200μg.kg-1体质量,分别在给药后第1、3、7、14、21、28天各屠宰3头取样,经HPLC-FLD分析。结果表明,皮下单次注射给药后,肌肉中药物残留量（2.1～9.3 ng·g^-1）低于美国规定的残留限量（10 ng·g^-1）;肝脏中药物残留量（29.8～625.1 ng·g^-1）低于美国、欧盟和CAC规定的残留限量（分别为4 800、1 500和2 000 ng·g^-1）;肾脏和脂肪中药物残留量（4.1～112.5ng·g^-1和2.1～96.4 ng·g^-1）都低于欧盟和CAC规定的残留限量（300和250 ng·g^-1）。采用欧盟官方推荐方法对残留浓度-时间数据统计分析,牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪休药期均为0 d。

高效毛细管电泳法测定牛奶和奶粉中残留的三聚氰胺

建立了牛奶和奶粉中三聚氰胺的高效毛细管电泳-二极管阵列检测器(HPCE-DAD)检测方法。使用长度58.5cm、内径75μm的毛细管柱,分离电压25kV,进样量3.5kPa(35mbar)×8s,分离温度25℃,缓冲溶液20mmol/L柠檬酸-40mmol/L磷酸氢二钠(pH2.6),检测波长232nm。分析物在1～100mg/L范围内线性良好,r2>0.997;牛奶和奶粉的定量限分别为0.5mg/kg和1.0mg/kg。在添加水平为定量限浓度至50mg/kg时的回收率为72.2%～97.3%,相对标准偏差为2.1%～3.9%。

喹诺酮类药物抗体制备研究进展及策略分析

氟喹诺酮类(Fluoroquinolones,FQs)各单体药物之间的化学结构极其类似,通常针对某一个药物制备的抗体对多种氟喹诺酮具有广谱识别性,是易于建立多残留免疫分析的代表性药物。本文综述了氟喹诺酮抗体制备和食品中的免疫分析研究进展,分析了已发表文章中以不同氟喹诺酮为半抗原所获得抗体对其它氟喹诺酮的交叉反应,并应用SYBYL.7.0程序包以MMFF94力场优化了8种批准用于动物的氟喹诺酮最低能量构象,从二维和三维构象角度对制备广谱氟喹诺酮抗体的策略进行了探讨,理论上提出了制备广谱氟喹诺酮抗体的途径。

饲料中3种四环素类药物的高效毛细管电泳检测方法

作者建立了鸡饲料中四环素、土霉素和多西环素的高效毛细管电泳检测方法。3种药物在40 mmol/L磷酸氢二钠-20 mmol/L柠檬酸（pH 2.6）的电泳缓冲液3、0 kV的分离电压、长度64.5 cm、内径75μm的毛细管内得到完全分离。在1-80 mg/kg范围内3种药物线性良好,R2〉0.994;配合饲料和预混料中3种药物的定量限分别为2和4 mg/kg;添加回收试验回收率〉80%,方法的日内变异系数和日间变异系数均〈10%。

饲料和食品中三聚氰胺的毒性及残留检测方法的研究进展

三聚氰胺本是作为生产三聚氰胺甲醛树脂的原料,被部分不法商贩利用,添加在饲料和食品中以造成表观蛋白质含量较高的假象。自2007年从中国进口的掺杂三聚氰胺的小麦蛋白粉原料引起的美国宠物食品污染事件后,陆续从大米粉、饲料、奶粉、鸡蛋等高蛋白类食品中发现三聚氰胺,已造成了严重的食物安全事故。文章综合了近几年有关三聚氰胺检测的最新报道,介绍了其毒性机理,首次从食品和饲料两个方面详尽论述了三聚氰胺现有的前处理方法和仪器方法,指出选择合适的提取方法和净化方法的重要性,为今后新方法开发提供参考。

荧光偏振免疫分析法研究17种磺胺类药物与抗体亲和力的构效关系

应用4株磺胺二甲基嘧啶(SMZ)多克隆抗体和5种不同结构的荧光标记物(Tracer)建立了荧光偏振免疫分析(FPIA)检测SMZ的方法.讨论了4株多抗对SMZ的检测灵敏度和对17种磺胺类药物(SAs)的相对亲和力趋势,从药物分子二维结构上探讨了多抗对小分子抗原的识别能力.结果表明,3号多抗对SMZ的灵敏度最高,但是4株多抗对17种SAs的相对亲和力趋势相似,说明抗体对抗原的结合力大小与抗原的化学结构有关.

兔排泄物中阿维菌类药物的高效液相色谱检测

建立了一种同时检测兔排泄物中阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、爱普菌素的高效液相色谱方法,样品用乙腈提取,Bond Elut C18柱净化,用三氟乙酸酐和1-甲基咪唑的乙腈溶液作衍生化试剂,然后加入冰乙酸和三乙胺进行衍生化反应30min,用液相色谱荧光检测器检测,该方法检测兔排泄物在2～10ng/g的添加范围内兔粪的平均回收率73.17%～101.30%,日内变异系数小于11.61%,日间变异系数小于11.31%,兔尿的的平均回收率在75.69%～101.84%,日内变异系数小于12.20%,日间变异系数小于10.880%,爱普菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在兔粪中的检出限为0.09～0.25ng.g-1,在兔尿中的检测限为0.04～0.28ng·ml-1。4种药在兔t兔粪便和尿液中的定量限分别是2ng·g-1和2ng·ml-1。该方法可靠、灵敏,可用于常规的残留检测。

牛皮下注射爱普菌素注射剂后组织残留预测模型研究

【目的】本文研究是为了探讨动物活体样品(血液等)与组织(肌肉等)中药物残留量之间的关系,并建立相应的预测模型。【方法】牛颈部皮下一次性注射抗寄生虫药爱普菌素注射液(1%),注射剂量为0.5mg·kg-1体重,分别在给药后第1、第3、第7、第14、第21、第28、第42和第56天,各屠宰3头取样用高效液相色谱分析。【结果】采用SPSS统计学软件,以消除相血液中爱普菌素残留为自变量拟合的预测模型回归方程,R2均大于0.9,方程拟合度经F检验,P值均小于0.001;以消除相粪便中爱普菌素残留为自变量拟合的预测模型回归方程,R2均大于0.8,方程拟合度经F检验,P值均小于0.001,说明回归方程具有显著的统计学意义。【结论】牛皮下注射爱普菌素后,血液或粪便中爱普菌素残留与可食组织中的残留具有很强的相关性。

虾肌肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的高效液相色谱检测方法研究

建立了虾肌肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的高效液相色谱检测法。以水和丙酮为提取溶液，Oasis MCX固相萃取柱净化，采用Inertsil ODS-3（5μm，250mm×4．6mmi．d．）反相色谱柱，以比例为68：32的A液（0．02mol／L戊烷磺酸钠-0．025mol／L磷酸钠溶液，pH3．85）与B液（含0．1％三乙胺的甲醇溶液）为流动相，在225nm处检测。氟苯尼考和氟苯尼考胺在10～1000μg／kg浓度范围内，线性关系良好；添加浓度为50、100、200、500μg／kg时，回收率在75．8％～85．9％，日内变异系数在2．4％～4．5％，日间变异系数在4．0％～5．8％；方法的检测限为10μg／kg，定量限为30μg／kg。本方法灵敏、准确、简便、快速，适于虾肌肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的同时检测。

牛皮下注射爱普菌素的组织药代动力学试验

牛皮下单次注射爱普菌素注射剂,剂量为0.5 mg/kg,给药后在不同时间点采取肌肉、肝脏、肾脏和脂肪等组织样品检测爱普菌素残留,采用3P97软件对组织残留-停药时间数据进行分析。结果表明,注射部位、肝脏中爱普菌素残留浓度变化符合二室开放模型,肌肉、肾脏、脂肪中EPR残留浓度变化符合一室开放模型。爱普菌素经皮下注射后Tmax均小于1 d（0.17-0.76 d）,Cmax范围在37.32-1453.79 ng/g之间。MRT范围在7.54-14.79 d之间,与T1/2el范围2.91-19.50 d相一致,说明药物在动物体内消除缓慢。

牛奶中土霉素残留检测方法改进及临床消除规律探究

试验对牛奶中的土霉素残留检测方法进行了改进,并采用改进后的方法对牛奶中土霉素的临床消除情况进行了探究.样品前处理过程中,选取0.1 mol/L Na2 EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取牛奶中的土霉素,正己烷除脂及HLB固相萃取柱净化浓缩.采用Symmetry Shield RP C18 （250 mm×4.6 mm,5μm）反相色谱柱,以乙腈和0.048％的磷酸溶液（pH 2.5）为流动相,采用梯度洗脱的方式对样品进行分析.方法改进后,土霉素的出峰时间为6.5 min,峰形尖锐,与样品中的杂质峰分离良好.土霉素标准溶液在5～2 000 μg/kg范围内线性关系良好,标准曲线R2 =0.9999;牛奶中土霉素在10、20、100 μg/kg 3组浓度的加标回收率分别为87.9％、90.5％和87.8％,批内变异系数范围为2.2％～5.8％,批间变异系数范围为4.0％～5.1％.土霉素在牛奶中的检出限为5 μg/kg,定量限为10 μg/kg,适用于研究土霉素在牛奶中的残留消除规律.选取了29头产后患有子宫内膜炎的奶牛,分成4个不同剂量组（2、3、4和5 g）,通过子宫内灌注土霉素的方式进行治疗,然后采用优化后的方法检测牛奶中残留的土霉素.结果发现,4 g及以下剂量组给药72 h后,牛奶中的土霉素可以消除至残留限量以下;而当给药剂量达到5 g时,72 h后牛奶中的土霉素未消除至残留限量以下,因此不建议采用5 g及以上剂量灌注病牛子宫.

高效毛细管电泳测定鸡蛋中三聚氰胺

建立了高效毛细管电泳-二极管阵列检测器检测鸡蛋中三聚氰胺的方法。样品用三氯乙酸提取,固相萃取小柱净化处理后进行检测,以50mmol/L甲酸-50mmol/L甲酸铵(pH2.5)为缓冲溶液,在总长度为58.5cm,内径为75μm的毛细管中,分离时间约6min,测得的定量限为0.25mg/kg。三聚氰胺浓度在0.25～5.0mg/kg范围内进行添加回收实验,平均回收率为80.2%～90.7%,相对标准偏差(RSD)为1.7%～3.4%。本方法简单易行、高效快速、经济环保,可以满足检测需要。

可视化凝胶酶联免疫吸附分析法检测牛奶中庆大霉素和卡那霉素

建立了牛奶中同步测定庆大霉素和卡那霉素的可视化凝胶ELISA方法。在凝胶检测柱的两个检测层中填充CN-Br活化的Sephrose 4B凝胶-羊抗鼠Ig G作为固相载体,加入药物的单克隆抗体与载体结合,酶标抗原和待测样本中的药物共同竞争有限的单克隆抗体,通过3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色定性判断药物的存在。本方法采用一步法,检测时间仅为15 min,对庆大霉素和卡那霉素的灵敏度为2.0μg/L,对牛奶中的两种药物检出限(Cut-off值)均为5μg/L。牛奶盲样比对实验表明,本方法与超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法测定结果相符。

庆大霉素与水溶性CdTe量子点的荧光共振能量转移作用

以巯基丙酸(mercaptopropionic acid,MPA)为稳定剂合成水溶性CdTe量子点(quantum dots,QDs),以CdTeQDs作为能量供体。庆大霉素(Gentamycin,GT)作为能量受体,建立了荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)体系。在690nm处可见发射峰,半峰宽约10nm,在一定范围内荧光强度与GT的含量呈线性关系,线性范围为2～20mg·L-1,相关系数r=0.9867。优化了不同的激发波长、pH、离子强度、时间和温度等因素对反应的影响,并应用傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)和高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)分别表征了化学结构和相对专一性。结果表明巯基丙酸的巯基中S原子和羧基中氧原子与纳米微粒表面的富Cd离子发生了配位作用,CdTeQDs与GT的耦合主要是通过量子点周围巯基丙酸羧基(—COOH)中的氧原子与GT的胺基(—NH2)形成分子间氢键实现的;GT与CdTeQDs的结合率为0.35∶1。研究表明GT可以作为检测CdTeQDs标记牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的荧光增敏剂,荧光强度值增强6倍,应用前景广阔。

一种基于荧光微球标记的卡那霉素免疫层析定量方法的建立

[目的]卡那霉素是一种在奶牛兽医临床常用药物,其在牛奶中的残留不容忽视。荧光微球作为一种新型的荧光示踪物,近年来在小分子快速检测方面呈现出独特的优势,试验开展了卡那霉素荧光微球免疫层析定量方法的研究,旨在为牛奶中卡那霉素药物的快速筛选提供新型有效的检测手段。[方法]采用戊二醛法和过碘酸钠法制备了两种卡那霉素的包被抗原(KANA-GA-OVA1、KANA-I2-OVA2),抗卡那霉素的单克隆抗体通过蛋白G免疫亲和柱进行纯化后,采用碳二亚胺法与荧光微球进行了共价偶联,成功制备了抗体-荧光微球标记物。免疫层析试纸条方法采用微孔测定法。包被卡那霉素包被抗原的NC膜作为固相载体,荧光微球标记的单克隆抗体与样品混合,在微孔膜的毛细管作用下,包被抗原和待测样本中的药物来共同竞争有限的单克隆抗体,通过荧光测定包被抗原结合的抗体量来评价待测样本中卡那霉素药物的含量。[结果]灵敏度试验表明,微孔中加入0、6.25、12.5、25、50、100、200μg·L-17个浓度梯度的标准品溶液,卡那霉素药物浓度的增加,试纸条T线的荧光强度逐渐减弱,呈现抑制状态,以无标准品抑制的荧光峰高值为F0值,相应浓度标准品抑制时的荧光峰高值为F值,以F/F0为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。利用Originpro 8.0软件拟合,曲线符合四参数方程,R2为0.9998,IC50值为24.8μg·L-1,线性范围(以20%—80%抑制率对应的浓度计算)为9.5—100μg·L-1,最低检出限(以10%抑制率对应的浓度计算)为5μg·L-1。准确度和精密度试验表明,以25、50和100μg·L-13个浓度添加水平,平均添加回收率为78.4%—92.7%,批内变异系数为10.8%—12.4%,符合残留检测的需求。特异性试验表明,试验建立的卡那霉素荧光微球免疫层析方法对其他常见的氨基糖苷类药物的交叉反应率均<1%,说明方法特异性良好。[结论]所建立方法快速灵敏、简单有效,特异性好,具有推广价值。

猪饲料中3种大环内酯类药物的高效毛细管电泳(HPCE)检测方法

建立了猪饲料中螺旋霉素、替米考星和泰乐菌素3种大环内酯类药物的HPCE检测方法。确定了该过程中缓冲溶液的pH、缓冲溶液类型及离子强度等电泳条件,同时对毛细管长度、内径及分离电压等仪器参数进行优化,得到分离的最优条件:在毛细管有效长度50 cm、内径75μm,分离电压25 kV,40 mmol/L磷酸氢二钠-20mmol/L柠檬酸(pH2.5)缓冲液条件下,3种药物在15 min内得到完全分离。3种药物在10~100μg/g范围内线性良好,R>0.9993;饲料中螺旋霉素检测限为3.0μg/g,替米考星检测限为5.0μg/g,泰乐菌素检测限为8.0μg/g,添加回收率在74.5%~87.4%,方法的日内变异系数<8.1%,日间变异系数<7.0%。本方法简单快速,分离环境为水相,经济又环保,适用于大量样本的筛选。

分子模拟技术研究17种磺胺类药物与抗体亲和力构效关系

应用量子力学AM1方法对17种磺胺类药物(Sulfonamides,SAs)进行分子构型优化,得到了SAs的最低能量结构,并计算了SAs分子的重要构型参数(键长、键角和两面角)、电性参数(R基团和重要原子的电量)和物化参数(水合能、LogP值等).通过比较SAs各个分子理化性质的差异,讨论了SAs与4株磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine,SM2)多克隆抗体之间的构效关系,结果显示水合能和LogP在SM2抗体-抗原(SAs)构效关系中发挥重要作用,分子的空间结构和电子特性的作用有限.