传染性海绵状脑病传播途径的研究进展

作者主要介绍了传染性海绵状脑病传播途径的研究进展,该研究对清楚地认识和预防该类疾病具有重要意义。

结核分枝杆菌感染实验模型

结核分枝杆菌是引起人结核病的主要病原,全世界约有1/3人口感染结核分枝杆菌。尽管该病原可感染并引起许多动物疾病,但人类是其中心宿主。为研究结核分枝杆菌的致病机理及宿主对本病原的保护性和免疫病理学反应,选择合适的动物模型非常必要。本文阐述了结核病研究中常用的实验模型及各种模型的优缺点。实验模型的合理应用将促进我们对结核病的认识,从中获取的资料将有助于我们发现更好的预防和治疗方案。

疯牛病和羊痒病Western blotting检测方法的建立

以朊蛋白单抗AH6和碱性磷酸酶标记的马抗鼠酶标二抗建立了疯牛病和羊痒病的Western blotting检测方法。对Western blotting各种反应条件进行摸索,并确定了最佳工作条件,结果表明:匀浆缓冲液为RIPA时的最佳反应条件包括浓缩胶电泳电压为恒压90V,分离胶电泳电压为恒压160V,转印的最佳电压和时间为恒压100V1.5h;封闭液为3%BSA时,封闭15min,封闭效果最好;AH6的最佳稀释度为1∶4000,4℃下孵育过夜,马抗鼠二抗的最佳稀释度1∶1000,室温下孵育30min。采用已确立的反应条件对样品进行检测并与Prionics-Check WEST-ERN进口试剂盒的检测结果比较,发现其敏感性为100%,特异性为99.4%,与进口试剂盒(100%,100%)无显著差异,这为国产试剂盒研制提供了条件。

PrP^c重组蛋白脑内接种金黄地鼠对mRNA表达的影响

为明确将牛PrPc重组蛋白接种金黄地鼠脑内是否引起异常临床表现、脑组织病理学变化及对其mRNA表达产生影响,为进一步研究PrPc蛋白与异构体PrPsc的结构转换机制提供基础数据,将纯化的牛PrPc重组蛋白磷酸盐缓冲液制剂进行地鼠颅内接种,约3μL/只,对照接种磷酸盐缓冲液(PBS);102 d后取出脑组织:一部分福尔马林固定后进行常规H.E.染色观察,另一部分提取脑组织总RNA,进行实时荧光定量RT-PCR检测。结果表明:处理未见临床异常表现;大脑、小脑、脑干组织病理学检测未见海绵状空泡变性和淀粉样斑;大脑PrPcmRNA表达水平无显著性差异。上述结果表明,用PrPc重组蛋白接种,在检测时间102 d内未引起金黄地鼠行为和脑组织的异常改变。

羊痒病概述

羊痒病(scrap ie)是传染性海绵状脑病(TSE)的原型,目前在世界许多地方流行。该病是绵羊的一种缓慢发展的致死性中枢神经系统变性疾病,能引起绵羊和山羊中枢神经系统发生退化变性,病羊具有中枢神经系统变性、空泡化、星形胶质细胞增生等特点,病羊表现为共济失调、痉挛、麻痹、衰弱和严重的皮肤瘙痒,病畜死亡率达100%。该病是由正常的朊蛋白(P rP c)发生错误折叠而变成异常的蛋白形式(P rP sc)引起的。

朊病毒致病机理的研究进展

就细胞型朊蛋白PrPc的分子生物学特性、朊蛋白的生理功能、致病性朊蛋白PrPsc对免疫系统的影响、朊病毒的外周致病机理以及相关细胞因子、化学因子与朊病毒神经侵袭之间的关系、朊病毒从外周到中枢的转运机制、入侵门户、血液传播及朊病的其他病理标志和检测方法的研究做一综述。

朊病毒的生物学研究进展

朊病是一种人畜共患病,对人和动物的健康影响很大,是一种致死性疾病。由于该病的临床症状和组织病理学变化等已为人们所熟知,作者仅就朊病的病因、发病机理及诊断治疗方法的最新研究进行阐述,并从病原基因遗传结构特点、致病蛋白的结构特点、诊断方法的提高、治疗的前景作一综述,为该类疾病的防治提供理论依据。

德州驴朊病毒基因克隆与序列分析

根据已报道正常哺乳动物朊蛋白(PrP)基因序列设计引物,采用PCR法扩增了德州驴的PrP基因,将其克隆到T-Vector。序列测定及分析表明所克隆的德州驴PrP基因片段为767 bp,该基因内无内含子,包含了驴PRNP完整编码区序列,编码256个氨基酸的前体蛋白,推测其分子量约34 ku。通过对德州驴朊病毒核苷酸和氨基酸序列与其他7种动物的比较,我们发现有3个区域变异较大,分别与种属屏障和潜伏期有关。经推测驴的PrP基因型是ARQ型,对羊痒病中度敏感,但是至今没有马属动物感染羊痒病的报道。这为TSE种间传播的突破提供了基础数据。

新时期人畜共患病的公共卫生意义

随着疫病诊断技术的提高和人类探索大自然的深入,以及病原微生物的不断进化,使旧的动物源性疫病不断再现,新的动物源性疫病不断发生。遵循人畜共患病控制的新理念,将人畜共患病控制放在疾病侵袭人类之前。要提高对动物在人畜共患病防控中的认识,强调在防控人畜共患病中,动物卫生和疫病的控制对人类疫病的防控发挥着重要作用。在人畜共患病中动物的作用可能是疫病发生、发展环节中的源头,是起始点,也是终点。没有动物病原的有效控制和净化,人类就很难控制和净化自身,应该看到在防控人畜共患病中人和动物同等重要,有时动物的问题可能更突出一些。研究人畜共患病控制对策,就要提高疫病诊断能力,增强疫苗研发能力。

朊病毒致病机理研究进展

朊病毒是一种无核酸但具有感染力的异常朊蛋白,可引起人和动物的神经退行性病变,该病结局是死亡。作者就朊病毒中枢神经系统感染机理,局部组织P rP sc聚集分布与P rP sc对神经组织损伤的关系、朊病中正常P rP c生理功能、细胞死亡可能机制、朊病中的神经炎—小胶质细胞的反应、补体激活作用;朊病毒外周神经系统感染机理,入侵门户、胞内转运机制、外周感染靶器官、胞内聚集与复制、神经入侵及朊病进程中已发现的几种受体细胞的重要作用等作一综述,为进一步研究该病提供理论依据。

免疫治疗朊病的前景

神经元的死亡被认为是朊病的特点,这是由于细胞表面的唾液酸糖蛋白由正常的含有大量α螺旋的结构变成了异常的β折叠丰富的、具有蛋白酶抗性的结构。最近的研究结果表明,朊病的复制可以被抗PrP的单克隆抗体所抑制,能延长朊病毒的潜伏期,这增加了人们用抗体来治疗朊病的信心。

朊病毒外周传播机理的研究进展

朊病是一种神经退行性疾病,能造成大脑神经细胞的广泛性损伤,最终导致死亡。一些朊病因子在感染部位向大脑入侵时先在淋巴组织中沉积,如在肠道中。对鼠模型的研究结果表明,这种沉积是必需的,它能使朊病因子有效到达大脑,如果这种在淋巴组织的沉积被阻断,就使疾病的易感性减弱。因此,鉴定在朊病毒到达大脑过程中参与的细胞和分子可以筛选出治疗本病的药物。作者就目前对朊病毒外周传播机理的理解作一综述。

实时荧光定量PCR构建朊病相关细胞因子标准品质粒和标准曲线

为能够用实时荧光定量PCR检测PrP106-126作用的鼠巨噬细胞细胞因子的表达水平,构建目的基因IL-1β、TNF-α、IL-6和内参基因β-actin的标准品质粒和标准曲线。根据GenBank中鼠基因编码区保守序列,设计特异性引物;细胞经PrP106-126作用后,提取总RNA。经反转录、PCR扩增、纯化、连接和转化后,提取质粒并测序鉴定,获得IL-1β、TNFα-、IL-6和β-actin质粒;将质粒梯度稀释,进行荧光定量PCR,获得标准曲线及回归方程。结果显示,产物溶解曲线峰值单一,引物特异性高;标准曲线相关系数r2=0.999,表明线性关系好,成功构建了目的基因和内参基因的标准品质粒和标准曲线。

饲料差异对动物实验研究的潜在影响

饲料在实验动物的生理发育中起着重要作用。高质量的动物饲料,可以优化大多数物种的生长、维持和繁殖。然而饲料具有高度可变性,饲料质量和组成的差异可能会影响动物/群体健康,并可能在以动物为基础的研究中引入复杂的变量,从而影响研究的再现性和可重复性。本文归纳总结了实验动物饲料差异的来源,探讨了饲料作为动物实验的外部因素如何影响动物健康、研究设计和实验结果可重复性等关键问题,并在此基础上为如何减轻这些影响提供参考。

犬皮肤组织细胞肿瘤的病理学观察与分析

对犬皮肤组织细胞肿瘤典型临床病例进行病理学分析,明确此类肿瘤分类,讨论该类肿瘤病理学特点,为临床诊断犬皮肤组织细胞肿瘤提供有效参考。中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室于2016~2017年间,从中国农业大学动物医院陆续收集共28例临床有关病例,通过制作病理切片、HE染色、镜下观察等步骤,进行病理学鉴别诊断,比较肿瘤的临床变化与病理组织形态。结果表明,分析、归纳犬皮肤组织细胞瘤、组织细胞肉瘤临床与病理学特征,为今后确诊此类肿瘤提供有用建议。犬皮肤组织细胞瘤、组织细胞肉瘤见于各个品种犬只,组织细胞肉瘤发病率相对较低;犬皮肤组织细胞瘤多发于头部和耳缘部,组织细胞肉瘤中多发于关节与四肢部,两类肿瘤具有特有的组织病理学形态。

重组绵羊pEGFP-PRNP质粒构建及真核细胞转染

构建了携带绵羊朊蛋白基因(PRNP)的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞(C6),以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。

朊蛋白基因在奶牛生殖系统不同组织中的表达量测定

为了研究疯牛病能够垂直传播的理论基础,我们采用PrP基因做目的基因,GAPDH基因做内参照的相对荧光定量RT-PCR方法,对目的基因和内参基因分别构建标准重组质粒,制备标准曲线,利用标准曲线对采集雌雄奶牛生殖系统的12个不同组织PrP基因表达进行定量。试验结果表明雌雄奶牛的生殖系统各部分组织都有PrP基因表达,其中雄性奶牛的睾丸、附睾和输精管呈现高的表达量,分别为1.16±0.0010、1.81±0.0056、0.68±0.0038;前列腺、精囊腺和尿道球腺呈现中等表达量,分别为0.47±0.0018、0.25±0.0007、0.28±0.0007;阴茎呈现低的表达量为0.18±0.0017;雌性奶牛的子宫、子宫阜呈现高的表达量,分别为2.53±0.0008、1.75±0.0098;卵巢和输卵管呈现中等表达量,分别为1.55±0.0038、1.45±0.0064;阴道呈现低表达量为0.57±0.0036。本研究为阐释PrP基因在奶牛生殖系统的正常表达和正常的生理功能,以及为确定生殖系统在疯牛病垂直传播中的地位和其分子机理奠定了基础。