秸秆种食菌 一箭射三雕——食用菌与环境保护及有机农业的关系

我国每年农林业的秸杆、枝杈等副产品约6亿吨,北京市每年也有300万吨.这些农林业副产品的75%～80%被用于牛羊的饲料、秸杆还田及农民的燃料等,剩余的20%～25%被焚烧,造成资源的浪费和环境的污染.每年麦收和秋收季节,焚烧秸杆形成的烟雾笼罩大地,严重时甚至影响飞机的降落.利用植物秸杆种植食用菌,是一种转化和利用秸杆的有效方法.2000年全国食用菌总产量为500多万吨,按各种食用菌的平均生物效率为30%来计算,2000年栽培食用菌所用的秸杆不到秸杆总量的3%,所以有很大发展潜力.

大豆根瘤菌剂在中国可持续农业中的应用

“大豆根瘤菌剂在中国可持续农业中的应用”第二次工作会议暨学术研讨会于2003年3月14-18日在中国农业大学举行。这次国际会议是欧盟资助的科技合作项目，参加者共24人，有英国约克大学Jane Thomas-Oates教授(项目协调人)等2人，荷兰莱登大学Herman Spaink教授等3人，西班牙塞维利亚大学Jose Enrique Ruiz Sainz教授等9人，中国农业大学杨苏声教授(会议承办人)等2人，华中农业大学周俊初教授，沈阳农业大学资环学院陈锡时教授，山两省农科院史清亮研究员，黑龙江省农科院于白双研究员，黑龙江绿丰生物有限肥料公司郭春景教授等2人，武汉Kernel生物技术公司工程师袁钢和四川省土肥试验站胡蕾副研究员。

中国北方地区甘草根瘤菌表型及遗传多样性研究

【目的】了解中国北方地区甘草根瘤菌的生物多样性。【方法】采用表型数值分类、16SrDNAPCR-RFLP分析和BOX-PCR指纹图谱分析的方法对北方地区的甘草根瘤菌进行表型、遗传多样性分析。【结果】供试菌株在数值分类聚类分析中约85%的相似水平上产生2个表观群,有11株菌未与已知参比菌株聚群。16SrDNAPCR-RFLP分析表明,供试的20株菌共产生14种遗传型,表现出丰富的遗传多样性。BOX-PCR指纹图谱分析进一步证明与甘草共生的根瘤菌的基因组也具有多样性。【结论】在中国北方地区与甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium属中均有分布。

新疆地区盐湖的中度嗜盐菌16S rDNA全序列及DNA同源性分析

通过数值分类和 1 6SrDNAPCR RFLP分析 ,对分离自新疆地区的中度嗜盐革兰氏阴性菌进行研究 ,发现了一个新类群。在此基础上 ,进行了中心株AI 3的 1 6SrDNA全序列分析 ,并与中度嗜盐菌已知种和相关种进行比较 ,得到系统发育树状图。在此树状图中 ,大多数参比菌株聚在一起 ,其 1 6SrDNA全序列的同源性在 96 %以上 ,而AI 3与参比菌株的 1 6SrDNA全序列相比 ,其相似性低于 75 %。但是 ,AI 3与Alcanivoraxborkumensis[1] 的 1 6SrDNA全序列的相似性为 96 % ,与Halobacilluslitoralis的 1 6SrDNA全序列的相似性为 99% ,三者构成一个独立的发育分支。这说明在系统发育上 ,AI 3与参比菌株属于不同的分支 ,是一个新的类群。在新类群内 ,菌株之间的DNA同源性大于 70 % ,而中心株AI 3与标准菌株伸长盐单胞菌(Halomonaselongata)的DNA同源性为 44% 。

阿维菌素高产菌株的选育及阿维菌素B_1的鉴定

自阿维链霉菌(StreptomycesavermitilisATCC31272)中分离出了3种不同类型的菌株,其中只有产灰色孢子的菌株能产生阿维菌素(Avermectins),摇瓶发酵单位约100μg/mL。经高频电子流诱变和对发酵培养基的改进,选育出Sa76菌株,其摇瓶发酵单位可达1000μg/mL。从其菌丝体中提取纯化了阿维菌素B1晶体,其紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振谱(1HNMR和13CNMR)和质谱与国外报道的一致。Sa76菌株又经2次亚硝基胍诱变,筛选出发酵单位2000μg/mL以上的Sa768菌株。在此基础上,再次用亚硝基胍对Sa768菌株进行了诱变,获得Sa769菌株,结合发酵条件的优化,其发酵单位可高达3500～4000μg/mL。

利用Tn5-1063转座诱变法分离苜蓿中华根瘤菌042BM noeB基因的研究

采用三亲本杂交方法将带有Tn5 10 6 3(含luxAB)的质粒pRL10 6 3a导入苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti) 0 4 2BM ,进行转座子插入诱变 ,在含有氯霉素、卡那霉素的TY平板上筛选接合子。通过结瘤试验 ,从 10 0 0个突变株中 ,筛选到 3个结瘤突变株 0 4 2BMR5、0 4 2BMR11和 0 4 2BRM2 9。它们都表现出发光酶活性 ,表明转座子正向插入到基因组中的某个启动子下游。Southern杂交结果证实 ,转座子均为单一位点插入。对 0 4 2BMR5突变株基因组进行反向PCR ,扩增位于Tn5 10 6 3两端的侧翼序列。测序结果表明 ,转座子插入到苜蓿中华根瘤菌的共生质粒pSymAnoeB基因内。根据基因组中noeB上游和下游序列扩增出 0 4 2BMnoeB ,其与苜蓿中华根瘤菌 10 2 1noeB的同源性为 98% ,而与NoeB蛋白的氨基酸序列相似性为 95 %。疏水性分析发现 ,NoeB是一个跨膜蛋白 ,在N末端有 4个跨膜区 ,其中包含 3个初级螺旋和 1个次级螺旋。

从豆科植物的根瘤中直接提取根瘤菌DNA的方法

豆科植物的新鲜根瘤经表面灭菌、破碎后直接加入 2 0 0 μL 4mol/L异硫氰酸胍 (GUTC)裂解液混匀 ,离心去掉根瘤残留物 ,再加入适量RNA酶 ,37℃温育 30min后 ,加入 2 0 μL硅藻土吸附液 ,室温处理 1 5min离心去掉上清 ,沉淀经GUTC裂解液二次处理 ,再分别用洗涤液、 70 %酒精洗涤。最后 ,硅藻土沉淀经真空干燥 ,加入 2 0 μL超纯水洗涤硅藻土沉淀 ,即可获得类菌体根瘤菌DNA。所获得的DNA可以用于AFLP、 1 6SrRNAPCR反应。

阿维链霉菌中aveD基因阻断对阿维菌素合成的影响

利用用于基因破坏的重组质粒pCZ2 (pKC1 1 39∷ 475bpaveD)对阿维菌素 (Avermectin)产生菌阿维链霉菌 (Streptomycesavermitilis) 76- 9的aveD基因进行插入失活 ,将获得的aveD破坏子进行摇瓶发酵和阿维菌素初步提取和HPLC检测 ,发现破坏子仅产生四个主要组分 ,但它们的保留时间分别比Bla、Blb、B2a和B2b的略长。进而将粗提液纯化并获得晶体 ,以UV、IR、NMR ( 1H NMR和13C NMR)和MS进行结构分析 ,并结合HPLC检验 ,证明它们属于C5 氧 阿维菌素B。说明阿维链霉菌的aveD基因破坏 ,不仅丧失了合成阿维菌素A组分的能力 ,也造成了其下游的aveF基因不能表达 ,因此只产生了C5 氧 阿维菌素B。

透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中的表达对其细胞生长及抗生素合成的影响

肉桂地链霉菌 (S .cinnamonensis)是莫能菌素 (Monensin)的产生菌。大肠杆菌 链霉菌穿梭表达载体pHZ12 5 2中的透明颤菌血红蛋白基因 (vhb)位于硫链丝菌素诱导启动子PtipA之下 ,它在肉桂地链霉菌中的结构不稳定 ,发生了重组缺失 ,缺失的片段包括大肠杆菌质粒部分和vhb基因。但来自阿维链霉菌 (S .avermitilis)中缺失了大肠杆菌质粒部分却保留了完整的vhb基因及tipA启动子的 pHZ12 5 2 ,可在肉桂地链霉菌中稳定复制 ,不再发生缺失 ,经硫链丝菌素诱导表达出了有生物活性的VHb蛋白。摇瓶发酵实验证明 ,VHb蛋白在氧限条件下可明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长和抗生素合成。

阿维链霉菌中aveD基因缺失对阿维菌素合成的影响

利用aveD基因的缺失载体pCZ8(pKC1 1 3 9∷△aveD)对阿维菌素 (Avermectin)产生菌阿维链霉菌 (Streptomycesavermitilis) 76 9的aveD基因进行缺失获得aveD缺失突变株。经摇瓶发酵和HPLC检测 ,发现该突变株只产生阿维菌素B组分。说明将阿维链霉菌的aveD基因缺失 ,并不影响下游aveF的表达。缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量基本相同 ,突变株中B1的产量略有提高 。

转座子挽救法对苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关基因的定位

用含Tn5转座子的质粒pRL10 6 3a诱变苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti) 0 4 2BM ,得到盐敏感突变株0 4 2BML 2。采用转座子挽救法对Tn5插入位点两边的序列进行克隆与测序 ,获得了 1179bp的转座子插入位点侧翼DNA序列。在GenBank中进行序列同源性和基因定位分析 ,结果表明 :转座子插入在一个功能未知的基因内部 ,此基因长 6 2 70bp。研究证明 :该基因与 0 4 2BM的耐盐性有关 ,并定名为rtsC。氨基酸疏水性分析表明 ,在RtsC蛋白的N端有两个跨膜区 ,该蛋白与细菌趋化性相关蛋白的功能域有同源性。并对RtsC蛋白在苜蓿中华根瘤菌0 4

新疆地区盐湖的中度嗜盐菌的数值分类

对来自新疆地区盐湖的 2 9株中度嗜盐菌与 9株相关的参比菌株进行了数值分类。这些菌株是革兰氏阴性菌 ,能在 0～ 2 5 %NaCl中生长。结果表明 ,所有菌株在 76 %的相似性水平上分为 2个表观群。群I为新分离的菌株共 2 5株 ,群II为 9株参比菌株和 4株新分离的菌株。在 86 %的相似性水平上 ,供试菌株分为 3个亚群。亚群 1由 1 0株新分离的菌株组成 ,亚群 2由 8株新分离的菌株组成 ,亚群 3由 1株新分离的菌株和 5株参比菌株组成。大部分新分离的菌株聚在独立的亚群中 ,说明分离自新疆地区盐湖的中度嗜盐菌是区别于参比菌株的新类群。

费氏中华根瘤菌与耐盐有关基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

费氏中华根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ）ＲＴ１９与耐盐有关的４．４ｋｂ ＤＮＡ片段含有３个相间的开放阅读框，经亚克隆及功能检测，证实其中的ＯＲＦ２与耐盐有关。将ＯＲＦ２分别克隆到表达载体以ｐＴＨｉｏＨｉｓＡ、Ｂ和Ｃ上，得到３个重组质粒ｐＧＡ、ｐＧＢ和ｐＧＣ，转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α。经ＩＰＴＧ诱导后和作ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，发现只有ｐＧＣ编码的融合蛋白获得了表达。其分子量为５３ｋＤａ，恰好是ｔｒｘＡ基因编码的硫氧还蛋白与推测的蛋白质分子量之和。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证实，表达的蛋白质是ｔｒｘＡ基因和目的基因编码的。

鹿角炭角菌等三种真菌多糖对HIV-RT的作用

热水抽提和酒精沉淀的方法提取鹿角炭角菌、香栓菌、茶树菇的多糖复合物 ,在反应浓度为 1mg/mL时 ,三种多糖对HIV逆转录酶活性的抑制率分别为 (80 4± 1 2 ) %、 (90 6± 1 7) %和 (84 5± 2 1) %。

苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关DNA片段的亚克隆和测序分析

将苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti) 0 4 2B与耐盐有关的 4kbClaⅠDNA片段克隆在 pML1 2 2上 ,用HindⅢ酶切下其 2 4kbDNA片段 ,回收后与 pBBR1 MCS2连接 ,然后转化大肠杆菌 (Escherichiacoli)DH5α,筛选到转化子GS2。将残留在 pML1 2 2上 1 6kbClaⅠ HindⅢDNA片段连同质粒一起回收 ,让其自连 ,转化大肠杆菌S1 7- 1 ,得到转化子GS0。以GS0为供体 ,0 4 2B的盐敏感突变株GZ1 7为受体 ,进行二亲本杂交 ,没有得到接合子。以GS2为供体 ,GZ1 7为受体 ,在辅助质粒pRK2 0 1 3的协助下 ,进行三亲本杂交 ,筛选到接合子GG2 ,获得 2 4kbHindⅢ与耐盐有关的DNA片段。将此片段连接到测序载体 pGEM 7Zf(+)上进行测序。测序结果表明 ,该 2 4kbHindⅢDNA片段含有 3个开放阅读框 (ORF)。在此基础上再一次亚克隆 ,获得 1 9kb与耐盐有关的DNA片段。

苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关基因rstA在大肠杆菌中的高效表达及其产物的纯化

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti) 0 4 2BM与耐盐有关的1 9kbDNA片段含有两个开放阅读框,采用PCR方法分别将它们扩增,连接到穿梭质粒上,并进行了耐盐功能检测,证明其中的ORF2具有耐盐性,定名为rstA基因。将它分别克隆到表达载体pThio HisA、B和C上,构建成重组质粒pGSA、pGSB和pGSC ,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)Top10后,经IPTG诱导,pGSA获得高效表达。表达蛋白占菌体总蛋白的36 % ,但大多数以包涵体形式存在。对表达产物依次进行ProBondTM树脂亲和纯化、饱和硫酸铵盐析,最后得到纯度为95 %的融合蛋白。SDS PAGE显示纯化的蛋白质为分子量4 3kD的单一蛋白带。

苜蓿中华根瘤菌042BMnoeA基因的克隆、敲除与功能的初步分析

通过PCR扩增获得了 0 4 2BM的noeA基因。该基因与苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobiummeliloti) 10 2 1noeA的同源性为 99% ,而其NoeA与 10 2 1NoeA的相似性为 97%。还发现其NoeA与中慢生根瘤菌 (Mesorhizobiumsp .)BNC1可能的SAM_依赖性的甲基转移酶相似性为 32 % ,而其 30 3～ 36 2氨基酸区域与大肠杆菌 (Escherichiacoli)的核糖体 5 0S亚基的L11蛋白甲基转移酶 (PrmA)的 16 0～ 2 2 0氨基酸区域的相似性达到 4 1%。通过插入卡那盒 ,敲除noeA ,获得突变株 0 4 2BMA_Km。与苜蓿中华根瘤菌 0 4 2BM相比 ,敲除noeA的突变株在普通紫花、保定、宁夏、百发和傲汉苜蓿品种上的结瘤数、根瘤鲜重和植株地上部分的干重都有不同程度的增加 ,而在秘鲁苜蓿品种上的结瘤数和植株地上部分的干重明显下降 ,在皇后和美国杂花苜蓿品种上则没有明显的变化。

苜蓿中华根瘤菌042B共同结瘤基因nodABC的克隆与序列分析

根瘤菌的ｎｏｄＡＢＣ和ｎｏｄＤ在结构和功能上保守，在不同的菌种之间能够互换［１］，是目前所有供试的豆科植物结瘤所必不可少的，称为共同结瘤基因。另一类是寄生专一性结瘤基因，如苜蓿中华根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）的ｎｏｄＰＱ等［２...

费氏中华根瘤菌042BS结瘤调节基因的克隆及功能检测

费氏中华根瘤菌 (Sinorhizobiumfredii) 0 4 2BS可以在大豆和苜蓿上结瘤。用费氏中华根瘤菌USDA2 5 7的nodD1和nodD2基因分别作为探针 ,与 0 4 2BS总DNA进行Southern杂交 ,发现其DNA经EcoRI酶切后分别在 3 0kb和 6 0kb处各有一条阳性带。回收这两条阳性带附近的DNA片段 ,建立部分基因文库 ,克隆到带有nodD1基因的 3 0kb片段 ,以及带有nodD2基因的 6 0kb片段。对nodD1和nodD2进行序列分析 ,结果表明 0 4 2BS的nodD1与费氏中华根瘤菌根瘤菌USDA2 5 7和USDA1 91的同源性高达 99% ,而nodD2与USDA2 5 7的同源性为1 0 0 %。再将nodD1的片段克隆到pBBRIMCS 5载体上 ,导入豌豆根瘤菌蚕豆生物变种 (Rhi zobiumleguminosarumbv.viciae)LPR5 0 5 4中进行功能检测 ,显示 0 4

苜蓿中华根瘤菌042BM noeAB基因的转录调控

对苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti) 0 4 2BMnoeAB基因的表达调控进行研究。结果发现,葫芦巴碱不能使noeAB的表达水平提高,证明它们的转录不受nodD2的调控。当nodD3和syrM同时存在时,noeAB的表达水平没有明显的变化,表明它们也不受nodD3 syrM系统的调控。在FY基本培养基上,毛地黄黄酮的诱导使noeAB基因的表达水平提高16倍,而在不添加该诱导物的TY培养基上,noeAB基因的表达水平也能够提高30倍以上,说明noeAB是受nodD1控制的,但除受毛地黄黄酮诱导外。