植物功能基因组研究中的基因敲除技术

综述了T-DNA插入突变和转座子插入突变等基因敲除技术的原理及其在植物功能基因组研究中的应用,并简要介绍了向国际有关机构索要或购买拟南芥插入突变体的方法。

植物微管结合蛋白AtMAP65-1在拟南芥气孔保卫细胞中的定位(简报)

植物细胞微管骨架的不同排列方式对细胞的生长分化及形态建成具有重要意义，微管的这种动态组织行为不仅需要自身的组成蛋白-微管蛋白（tubulin），还要有微管辅助蛋白MAPs（Microtubule—associated proteins）的参与。即MAPs是一类能够与微管骨架特异结合并调节其动态装配过程及其结构.

萱草花粉中微管蛋白生物化学性质

微管(microtubule)是细胞骨架的重要成份,参与囊泡运输、信息传递等多种生命活动。我们从萱草花粉中纯化了植物微管蛋白,对其生物化学及生物物理学部分性质研究表明,纯化的微管蛋白经超离心法测定沉降系数为6.2S,SDS-PAGE分析α,β微管蛋白分子量为56kD、58kD,凝胶扫描分析纯度为93.7%。等电聚焦电泳测定等电点为pI=5.35。光谱学性质研究结果表明,最大紫外吸收峰为280.8nm,荧光光谱研究表明最大激发波长为282nm;此时的最大发射峰为338nm,圆二色光谱分析二级结构表明α-螺旋占27.24%,β-折叠占24.48%,无规卷曲为48.28%,呈典型球蛋白特征。

萱草花粉类动力蛋白生物物理学及药理学性质(英文)

利用FPLC技术从萱草花粉中鉴定并纯化了动力蛋白,研究了它的酶学性质及部分生物化学性质。结果如下:纯化的类动力蛋白分子量为100kD,等电点pI=6·15和6·80。在280nm波长激发下,最大的荧光发射波长是346nm。荧光光谱分析结合紫外吸收光谱及导数光谱分析推断它含有色氨酸和酪氨酸残基。药理学性质研究表明巯基可能在酶的活性中心起重要作用。

玉米Na^＋／H^＋反向转运器编码基因ZmNHX的克隆及其表达特性分析

植物液泡膜Na+/H+反向转运器在植物耐盐性方面发挥着重要的作用.根据序列同源性比较分析结果,利用RACE技术获得了一个与水稻Na+/H+反向转运器基因OsNHX1具有高度序列同源性的玉米Na+/H+反向转运器基因(命名为ZmNHX)的全长mRNA序列.对正常及胁迫条件下的玉米幼苗进行Northern blot分析发现, ZmNHX基因的表达受NaCl、LiCl、甘露醇和ABA诱导.玉米ZmNHX在盐胁迫适应过程中可能起着非常重要的作用.

G蛋白可能参与细胞外钙调素促进蚕豆气孔关闭的过程

存在于蚕豆保卫细胞质外体的细胞外钙调素(CaM)具有调控气孔运动的重要作用。以蚕豆表皮条为材料,利用激光共聚焦显微技术以及表皮条的生物分析方法研究了细胞外CaM促进气孔关闭的机理。实验结果表明,细胞外CaM能诱导保卫细胞[Ca^(2+)]_(cyt)升高,且升高程度随细胞外Ca^(2+)浓度的升高而增加;使用Ca^(2+)通道抑制剂的结果表明细胞外CaM诱导保卫细胞[Ca^(2+)]_(cyt)升高的过程以细胞外Ca^(2+)内流为主,利用G蛋白抑制剂PTX和激活剂CTX后发现,PTX能抑制细胞外CaM诱导的保卫细胞[Ca^(2+)]_(cyt)升高和气孔关闭,CTX也能通过诱导保卫细胞[Ca^(2+)]_(cyt)升高来促进气孔关闭,且Ca^(2+)主要来源于细胞外。说明G蛋白可能参与了细胞外CaM促进气孔关闭的过程。根据以上结果我们提出了细胞外CaM调控气孔运动的可能模式:细胞外CaM可能通过激活保卫细胞G蛋白打开质膜Ca^(2+)通道,诱导细胞外Ca^(2+)内流,导致气孔关闭。

保卫细胞钙信号的研究进展

钙 (Ca2 + )是多种信号途径的第二信使。Ca2 + 成像技术的成熟和发展为显示保卫细胞胞质Ca2 +浓度 ([Ca2 + ]cyt)的分布及外界刺激引起 [Ca2 + ]cyt的变化模式提供了很好的研究工具 ,关于细胞内外Ca2 +库释放Ca2 + 的机制也有了较清楚的认识。拟南芥突变体的研究使Ca2 + 信号上游分子及其排序更加明确 ,[Ca2 +

扩张蛋白在旱稻根的免疫组化定位及对旱稻抗旱性的表达分析

扩张蛋白是一类细胞壁非酶蛋白,在植物发育进程中起着重要作用．本实验以旱稻为材料,通过AtExP1抗体对扩张蛋白在旱稻根中的定位及可能的作用机制进行了探讨．研究表明扩张蛋白参与了旱稻根系的生长发育,且更可能是促进了侧根、不定根的生长．利用OsEXP3基因特异性片段,即部分3’-UTR片段作为探针模板,通过Northern杂交技术对其在4种抗旱性不同的旱稻以及干旱胁迫条件下的表达特性进行了分析．结果显示:OsEXP3基因受到干旱胁迫的正调控,且其表达量与旱稻的抗旱性呈现正相关．由此推测,在干旱胁迫条件下,扩张蛋白很可能是通过促进侧根与不定根的生长发育来提高旱稻的抗旱性．

蚕豆保卫细胞中钙调素的免疫电镜定位

以蚕豆横切和平切气孔为材料 ,对钙调素进行了免疫胶体金电镜定位的结果表明 :在蚕豆保卫细胞的细胞核、细胞质、细胞膜、叶绿体、液泡、高尔基体、细胞壁中都有金颗粒分布 。

Pal min诱导烟草氧化猝发的机制(英文)

为探讨植物对病原微生物的防御机制和激发子启动植物体内的信号转导应答过程 ,本文研究了Phytoph thorapalmi激发子palmin诱导其非寄主亲和性烟草的叶片和悬浮细胞系产生氧化猝发的分子机理。利用生化分析和激光共聚焦显微扫描技术动态观察palmin诱导烟草过敏反应中O·- 2 和H2 O2 的形成、胞间转移及引起细胞死亡的特性。结果表明 :palmin诱导激活了烟草细胞内NADPH氧化酶 ,产生大量的O·- 2 ;O·- 2 在SOD催化下迅速转变成H2 O2 ,并且H2 O2 在一定范围的细胞间转移和积累 ,最后诱发烟草细胞的过敏性坏死反应。palmin诱导氧化猝发过程还有Ca2 +和蛋白激酶的参与。

蚕豆类水孔蛋白基因的克隆及表达

为了解水孔蛋白在气孔运动中的作用,通过5’/3’RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术从蚕豆(Vicia.faba)叶片表皮cDNA中克隆出1个编码290个氨基酸的类水孔蛋白基因VfPIP1(Vicia faba plasma membrane intrinsic protein gene),GenBank登录号为AY667436.应用计算机软件对VfPIP1的氨基酸序列分析表明,VfPIP1含6个跨膜区,具有质膜水孔蛋白的特征信号序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN,属于PIP1亚家族成员. 原位杂交及Northern blot分析显示,VfPIP1在保卫细胞中有较强的表达信号,并受脱落酸(ABA)诱导.上述结果为研究水孔蛋白VfPIP1在气孔运动中的作用及其活性调节机制打下了基础.

微管骨架在轮藻节间细胞伸长生长中的作用

利用免疫荧光定位及激光共聚焦扫描显微镜,结合细胞生长曲线的定量测定,对不同生长阶段的轮藻节间细胞微管骨架进行了观察研究,结果如下:轮藻顶端生长活跃的新生细胞中,与细胞长轴垂直的周质微管(cortical microtubules)占绝对优势,随着生长速率的减慢,周质微管由垂直于细胞长轴逐渐转为平行排列;基部生长基本停止的节间细胞中,胞内微管则以平行细胞长轴为主;不同生长阶段节间细胞的微管骨架,对微管特异解聚剂黄草消(oryzalin)处理的敏感性表现不相同。顶端生长活跃的节间细胞经oryzalin处理40min后,绝大多数周质微管发生解聚;而基部生长基本停止的老细胞中,即使延长处理时间,仍残留一些尚未完全解聚的微管片段;10μmol/L微管解聚剂oryzalin处理轮藻顶端新生细胞,在高精度的细胞伸长生长测定装置监测下,发现oryzalin对细胞的伸长生长速率有明显的抑制作用,去掉药剂后,伸长生长又有一定的恢复。并且发现,经o-ryzalin处理后,微管的解聚(40min左右)与顶端节间细胞伸长生长的停止(100min左右)两者间存在着时间上的差异,即微管解聚在先,细胞伸长停止在后。以上结果均说明微管骨架在轮藻节间细胞生长中具有重要作用。

蚕豆水孔蛋白可能参与微丝骨架对气孔运动的调节

水孔蛋白的抑制剂HgCl2可明显抑制壳梭孢菌素(FC)和微丝骨架的解聚剂细胞松弛素D(CD)对蚕豆保卫细胞原生质体膨胀的诱导作用,而对微丝骨架的稳定剂鬼笔环肽(phalloidin)的抑制作用影响不明显。这表明水孔蛋白可能介导了FC和微丝骨架对气孔运动的调节。

旱稻OsEXP3与OsEXP5基因的mRNA表达差异分析

OsEXP3基因和OsEXP5基因是GenBank上登录的从水稻中克隆的扩张蛋白基因。本研究根据其报道的mRNA序列设计引物,利用RT-PCR技术从4种旱稻根系中克隆了这2个基因的部分编码框序列,证明OsEXP3与OsEXP5基因在旱稻的根系中表达;通过Northern-blot技术对该表达特性进行了研究。结果表明,OsEXP3与OsEXP5基因在旱稻IRAT109根中的表达受到生长发育阶段的调控;受到激素ABA、干旱胁迫的正调控;且受干旱胁迫诱导表达的生长阶段不同。以上实验结果推测在干旱胁迫条件下很可能OsEXP3与OsEXP5基因在不同的生长阶段发挥各自的主要生理功能。

拟南芥PKA催化亚基基因的克隆、原核表达及其催化活性的鉴定(英文)

蛋白质的磷酸化与脱磷酸化是生物体内存在的一种普遍的调节方式 ,几乎参与所有的生命活动过程。利用Blast2 .0分析拟南芥基因组序列发现存在一个与动物蛋白激酶cDNA同源性的序列 ,在GenBank中比较发现它与动物的依赖cAMP的蛋白激酶 (PKA)的催化亚基 (C亚基 )有相似的特征序列。提取拟南芥 (Arabidopsisthaliana(L .)Heynh .)的总RNA ,通过RT_PCR克隆得到这一cDNA片段 ,经序列测定证实它具有完整的阅读框架 ,将其克隆至pET30a原核表达载体 ,结果表明在大肠杆菌 (E .coli)BL2 1 (DE3)中该表达质粒在IPTG诱导下表达产生大量带寡聚组氨酸标记的重组蛋白 ,该蛋白在 37℃表达时主要以包含体形式存在 ,而在 2 2℃表达时主要以可溶性蛋白形式存在。经过与组氨酸结合金属螯合树脂亲和柱层析纯化后 ,得到纯化的目的蛋白 ,其纯度达到 87%以上。活性鉴定表明其具有依赖于cAMP的蛋白激酶活性 ,而加入PKA的抑制剂 (H_8)后 ,其活性显著下降。从而证实它确实是拟南芥的PKA催化亚基。Westernblot结果显示它几乎不受ABA、NaCl等逆境的诱导。

豌豆根胞质V_1-ATPase的鉴定(英文)

利用免疫印迹、免疫电镜和ATP水解活性的测定对豌豆 (PisumsativumL .)根细胞胞质中V1_ATPase复合物的存在进行鉴定。用兔抗绿豆V_typeH+ _ATPase的A、B亚基的抗体进行的immuno_blotting和胶体金电镜结果都表明 ,胞质中存在有A、B亚基。活性测定结果进一步表明胞质具有ATP水解活性。这些结果说明豌豆根胞质具有有活性的V1_ATPase复合物。这是首次直接证明植物中有胞质V1_ATPase的存在。

保卫细胞中的微丝骨架

微丝骨架存在于多种植物的保卫细胞中 ,周质微丝骨架的排列和结构是动态的。越来越多的证据表明保卫细胞中的微丝骨架可作为信号调节物 ,对气孔的启闭运动起着重要的调控作用。本文综述了保卫细胞微丝骨架的标记方法、结构 。

拟南芥扩张蛋白AtEXP1参与气孔运动的调控

本文以过量表达扩张蛋白AtEXP1的转基因烟草为材料,通过分析不同刺激因子作用下,AtEXP1的过量表达对烟草气孔运动的影响,研究了扩张蛋白AtEXP1是否参与气孔运动的调控作用。表皮条的生物学分析表明,AtEXP1的过量表达促进了光和K+诱导的气孔开放,以及Ca2+、ABA和黑暗诱导的气孔关闭过程,但对气孔密度影响不大;充足光照、水分供应条件下,成熟转基因烟草植株的光合与蒸腾速率均明显高于野生型。以上结果表明AtEXP1的过量表达提高了气孔对环境刺激应答的灵敏性,这可能是由于AtEXP1的过量表达改变了保卫细胞细胞壁的特性,进而参与了烟草气孔运动的调控。说明AtEXP1在气孔运动中发挥积极的调控作用。

萱草花粉微管蛋白的体外聚合及电镜观察

微管(microtubule)作为细胞骨架的主要成分,在植物体内,微管除决定细胞的形状外,还参与很多重要的细胞功能。但有关微管蛋白生物化学的研究绝大多数来自动物脑组织材料,对植物微管蛋白的研究除培养细胞外所知甚少,我们纯化了毫克数量的萱草(Hemer-ocallis fulvaL.)花粉微管蛋白,利用紫杉醇作为促进剂,在Mg2+、GTP等存在下体外聚合成功,并观察了其电镜下的形态。

蚕豆成熟叶片中扩张蛋白的存在及其功能研究

以已经停止生长的蚕豆(Vicia faba L.)成熟叶片为材料,利用免疫印迹、体外重组、免疫组织化学定位和药理学实验证明:已经停止生长的蚕豆成熟叶片中存在扩张蛋白,主要分布于保卫细胞壁中,而且背壁中较多;蚕豆成熟叶片中的扩张蛋白除具有扩张蛋白的一般特性外,其活性还可被K+激活;用扩张蛋白处理蚕豆表皮条可以促进光诱导的气孔开放,提示蚕豆成熟叶片中的扩张蛋白可能参与了气孔运动的调控过程.以上结果不仅证明了在已经停止生长的叶片中存在扩张蛋白.而且为深入阐明细胞壁调控气孔运动的作用机理的研究提供了新的线索.