日本血吸虫重组抗原SjPGAM-SjEnol的保护性免疫效果评价

目的构建日本血吸虫重组表达质粒pET32a-SjPGAM-SjEnol并在大肠埃希菌（E.coli BL21）中表达,观察重组抗原在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用。方法利用生物信息学技术筛选SjPGAM和SjEnol富含人源（HLA）Ⅱ类、鼠源（H2-d）Ⅱ细胞结合表位且与宿主同源性较小的肽段,将对应编码的核苷酸序列进行拼接,构建重组质粒pET32a（＋）-SjPGAM-SjEnol,并在E.coli BL21中表达。用蛋白质印迹（Western blotting）分析该重组抗原的抗原性。用小鼠实验评估重组抗原的免疫保护效果,即将55只雄性BALB/c小鼠均分成5组,其中3个试验组分别用重组抗原pET32a-SjPGAM-SjEnol（A组）、pET28a-SjPGAM（B组）、pET28a-SjEnol（C组）（各27μg）与206佐剂混合后免疫小鼠,每次间隔2周,共免疫3次。同时设佐剂对照组（D组）和空白对照组（E组）。末次免疫后2周,每鼠经腹部皮肤分别感染日本血吸虫尾蚴40±2条,感染后6周,经肝门静脉灌注法收集成虫和检测每克肝虫卵数（EPG）,计算减虫率和肝脏减卵率。各组小鼠分别于免疫前、各次免疫后1周尾部取血和剖杀时收集血清,应用ELISA检测血清特异性IgG抗体水平。结果确定SjPGAM的96~147、SjEnol的233~312肽段为重组片段。PCR扩增出一条含编码这两个肽段的核苷酸序列的重组DNA序列,大小447bp。获得的重组蛋白pET32a-SjPGAM-SjEnol相对分子质量（Mr）为33000。Westernblotting结果显示,该重组蛋白可被日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清识别,具有良好的抗原性。小鼠免疫实验结果显示,与空白组相比,A组获得39.7%的减虫率和64.9%的肝减卵率,其减虫率与B组（18.5%）、C组（14.7%）比较,差异有统计学意义（均P〈0.05）;肝减卵率与B组（47.5%）、C组（30.5%）比较,差异也有统计学意义（P〈0.05,P〈0.01）。ELISA结果显示,第3次免疫后A组的特异性IgG抗体达到较高水平（2.372±0.268）,与D组（0.490±0.138）、E组（0.220±0.088）间的差异有统计学意义（P〈0.01）。结论成功构建了重组表达质粒pET32a-SjPGAM-SjEnol,多表位重组蛋白pET32a-SjPGAM-SjEnol在小鼠抗血吸虫感染中比单一重组抗原pET28a-SjPGAM和pET28a-SjEnol诱导了更高的免疫保护作用。

吡喹酮直肠给药治疗小鼠血吸虫病实验研究

目的观察吡喹酮直肠给药对小鼠日本血吸虫病的治疗效果。方法各实验组每只小鼠分别腹部贴片感染日本血吸虫尾蚴40±2条。感染后第42天以吡喹酮直肠给药,按给药不同剂量设为3组,每组每只小鼠按100、200、400mg/kg一次给药,同时设不给药对照组。给药1周后进行剖杀,计算减虫率、减肝卵率以及减配对率。结果 200mg/kg组减虫率为57.63%,减配对率为76.60%;400mg/kg组减虫率为49.15%,减配对率为51.06%,减虫率、减配对率效果优于100mg/kg组。结论吡喹酮直肠给药方式效果较好,可为防治家畜血吸虫病提供新的选择。

日本血吸虫4个基因启动子相关序列的克隆和初步研究

目的比较4个日本血吸虫基因启动子相关序列对荧光素报告基因的表达情况。方法利用PCR技术扩增4个日本血吸虫基因启动子的相关序列,并利用常规分子生物学技术将PCR产物克隆到荧光素酶报告基因的上游。利用脂质体转染和电穿孔技术将纯化的重组质粒分别转染到HEK293细胞和日本血吸虫体内,并以荧光素酶检测系统测定了报告基因表达情况。结果PCR扩增获得了日本血吸虫卵壳蛋白(Eggshell protein,ESG-2A)、延伸因子1(Elongation factor 1 alpha 1,EF)、烯醇酶(Enolase,EN)和抱雌沟蛋白(Gynecophornal canal protein,GCP)基因的启动子相关序列,并将它们成功地克隆到pGlu-Basic载体。重组质粒转染表明4个日本血吸虫启动子相关序列均可驱动荧光素酶报告基因在HEK293细胞和日本血吸虫虫体表达。其中含有GCP和EN启动子相关序列的重组质粒可在HEK293细胞及其培养基中检测到较高的荧光素酶活性,含有GCP和ESG的重组质粒可在日本血吸虫虫体培养基中检测到较高的荧光素酶活性。结论获得的4个日本血吸虫启动子相关序列均可驱动荧光素酶报告基因在HEK293细胞和日本血吸虫虫体表达,为进一步利用这些启动子相关序列开展血吸虫基因操作研究奠定了初步基础。

新西兰大白兔感染日本血吸虫不同时期内脏沉积虫卵特征与病理变化

目的观察感染日本血吸虫不同时间动物内脏中沉积虫卵的分布特征及组织病理变化。方法新西兰大白兔定量人工感染血吸虫后,比较感染后42、60 d沉积虫卵在组织中的分布特征、虫卵孵化率的变化以及相应部位的病理改变。结果感染42 d时,沉积虫卵百分比、每克组织沉积虫卵数及沉积虫卵孵化率最高的均为肝脏;感染60 d时,上述3个指标值最高的分别为肝脏、直肠和小肠上段。从感染后42 d到60 d,兔肝脏肿大,且由黑色逐渐变成暗灰色并失去弹性而硬化,小肠各段逐渐出现虫卵结节,结肠、盲肠和直肠可见黏膜充血、水肿、结节,病变程度与虫卵的沉积相关。结论新西兰大白兔感染日本血吸虫后不同时期,不同器官组织的沉积虫卵数量、密度及虫卵孵化率均有差异,且沉积虫卵的分布和宿主病理损伤程度有关。

密码子优化对鸭坦布苏病毒E基因DNA疫苗免疫应答的增强作用

为提高DNA疫苗用于预防鸭坦布苏病毒病的免疫原性,将鸭坦布苏病毒的E基因密码子改造为鸭偏嗜的密码子,并将其作为免疫原基因克隆到pCAGGS载体中,构建真核表达质粒pCAGGS-OptiE。将pCAGGS-OptiE和先前构建的编码野生型E基因的表达质粒pCAGGS-E分别转染293T细胞,用间接免疫荧光和Western-blot检测E蛋白的表达情况。结果显示,密码子优化的重组质粒的蛋白表达量明显高于野生型质粒。将重组质粒pCAGGS-OptiE和pCAGGS-E用脂质体包裹后分别尾静脉注射免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测抗体的产生情况。结果显示,质粒pCAGGS-OptiE诱导的抗体水平明显高于pCAGGS-E,表明密码子优化的E基因能够提高蛋白的表达水平,进而增强机体免疫应答反应。

微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型的建立及不同阶段虫体形态的观察

利用人回盲肠癌(HCT-8)细胞作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养,观察细胞的生长状况;在培养细胞中加入1×105个经活力检测的微小隐孢子虫卵囊,培养72h后用荧光标记的隐孢子虫卵囊、子孢子染色试剂盒Crypt-a-Glo和Sporo-Glo进行染色,观察不同发育阶段的隐孢子虫形态。结果显示,在六孔培养板中接种10×105个细胞后,24h后长成80%～100%单细胞层,可以用来接种微小隐孢子虫。培养72h后观察到了隐孢子虫各个阶段虫体的形态。结果表明,成功建立了微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型。