马动脉炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建

根据马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)Bucyrus株全基因组序列设计并合成EAV特异引物,进而应用RT-PCR技术分6段扩增了EAV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片段PE124、PE631、PE1854、PE5191、PE61107、PE97Q分别克隆到载体PCR BluntⅡ-TOPO中,建立了EAV初级cDNA克隆。在扩增5′末端时,引入NotⅠ酶切位点和T3启动子序列;在基因组3′末段PolyA尾引入XhoⅠ酶切位点,后者供cDNA模板的线性化之用。将扩增片段在PCR BluntⅡ-TOPO中依次连接,最后亚克隆到质粒pBluescriptⅡKS(+)中,获得了EAV全长基因组cDNA克隆pWEAV。核酸序列分析表明:该毒株基因组全长为12 704个核苷酸,与EAVBucyrus分离株的同源性为99.1%;全长基因组中有104个核苷酸发生突变,相应地导致编码区内34个氨基酸的改变。