抗大田软海绵酸单克隆抗体的制备及免疫学特性分析

目的制备了赤潮毒素大田软海绵酸(okadaic acid,OA)单克隆抗体,并分析其免疫学特性。方法用人工抗原大田软海绵酸-小牛血清蛋白偶联物(OA-BSA)免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术经初筛、复筛和亚克隆,筛选到1株可稳定分泌抗OA单克隆抗体的杂交瘤细胞株3H4。对抗体效价、亚型、特异性、敏感性进行免疫学鉴定与分析。结果抗体亚型为IgG2b;腹水效价为1∶1.28×106;50%抑制质量浓度为2.852 ng/ml;最低检测限为0.45 ng/ml;电泳结果显示抗体,由1条重链和1条轻链组成;与OA同系物PTX1、GYM、SPT1、YTX交叉反应率为0。结论制备的OA单抗效价和特异性均较好,可用于OA的免疫学检测。

孔雀石绿单克隆抗体的制备及其鉴定

用人工合成的无色孔雀石绿-兔血清白蛋白(LMG-RSA)作抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术筛选抗无色孔雀石绿的单抗,单抗经纯化后对其特异性和灵敏性进行了鉴定,探讨了建立孔雀石绿的免疫学检测方法。结果显示,经细胞融合和筛选得到了1株分泌抗无色孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞5E9。经鉴定,该杂交瘤细胞的染色体数为98.82±5.6,间接ELISA检测小鼠腹水的抗体效价达1.3×105,该细胞连续培养10代以上,生物学性状稳定,间接竞争ELISA(ciELISA)结果显示,无色孔雀石绿50%抑制的质量浓度为18.5μg/L,除孔雀石绿外,与其他类似结构和相关类型的药物没有交叉反应,表明该单抗用于孔雀石绿的检测有较大的应用价值。

孔雀石绿间接竞争ELISA检测方法的建立

采用无色孔雀石绿(Leucomalachite green,LMG)单克隆抗体建立了水产品中孔雀石绿(Malachite green,MG)残留的间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法。结果表明,LMG-McAb最佳稀释倍数为1∶80 000,包被抗原最佳质量浓度为0.80μg/mL;竞争反应时的LMG理想稀释液为40%乙腈水溶液;标准曲线呈线性相关,相关系数R2=0.9823,最适检测范围1 ng/mL^256 ng/mL,最低检测限为1.29 ng/mL,批内和批间变异系数分别为4.307%和4.566%;鳗鱼肉样的平均添加回收率为90%~110%;该检测方法与隐性结晶紫、孔雀石绿、结晶紫的交叉反应(CR%)分别为40.67%、13.50%和5.89%,与其他抗生素无交叉反应。

7种药物体内外抗弓形虫效果分析

为了初步了解甘草酸、苦参碱、黄芩苷、硝唑尼特、巴龙霉素、磺胺嘧啶钠和磺胺氯吡嗪钠7种药物抗弓形虫的效果,进行体外、体内抗弓形虫试验。采用MTT法首先测定试验药物对培养巨噬细胞(Ana-1)的安全浓度,然后用弓形虫RH株的速殖子感染培养的上述细胞,加入药物继续培养48 h后观察药物体外抑制虫体在细胞内的增殖,以相对弓形虫抑制率为指标判断体外抗弓形虫效果。用弓形虫RH株速殖子按5×105/只腹腔接种昆明种小鼠,接种后4 h,药物治疗组通过饮水中给药,观察比较给药后感染弓形虫小鼠的精神状态,并记录各组小鼠死亡的时间和数目,每组随机抽选2只小鼠镜检腹腔虫体数量。体外试验结果表明,甘草酸、黄芩苷、磺胺嘧啶钠和磺胺氯吡嗪钠4种药物可显著抑制细胞内弓形虫增殖;体内试验表明,磺胺氯吡嗪钠治疗效果最佳,磺胺嘧啶钠次之,黄芩、苷草再次之,其余药物抗弓形虫作用不明显。

呋喃它酮代谢物人工抗原及多克隆抗体的制备

本文利用对醛基苯甲酸(CPA)与呋喃它酮代谢物(AMOZ)进行衍生化,得到衍生物CPAMOZ,并通过质谱法对其结构进行确证。然后采用混合酸酐法将CPAMOZ与载体蛋白偶联,采用紫外扫描(UV)法对偶联物进行验证。用偶联成功的人工全抗原(CPAMOZ-BSA)免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定小鼠血清抗体效价为1∶8×104,对NPAMOZ的半数抑制量为26.55μg/L,间接竞争ELISA鉴定小鼠血清多克隆抗体,与NPAMOZ、CPAMOZ的交叉反应率分别为100%、44.8%,与AMOZ、对醛基苯甲酸、对硝基苯甲醛以及同类其他三种药物呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮等原药及其代谢物以及代谢物衍生物的交叉反应均小于0.01%。结果表明,制备的AMOZ多克隆抗体效价高、特异性强,灵敏度高,为进一步制备AMOZ单克隆抗体和研制快速筛选检测试剂盒奠定了基础。

抗大田软海绵酸单克隆抗体的制备与间接竞争ELISA的建立

用大田软海绵酸(okadaic acid,OA)与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物OA-BSA作为免疫原,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备OA单克隆抗体,并以纯化的抗体为探针建立了检测OA的快速、灵敏、简便的间接竞争ELISA(ciELISA)。回归方程和相关系数分别为:y=-0.3949x+0.6312,R2=0.9806;线性范围为0.3125~20 ng/mL;对OA的最低检出质量浓度为0.175 ng/mL;批内和批间变异系数分别为2.09%和3.27%;扇贝肉样的添加回收率为74.2%~80.8%;与鳍藻毒素(DTX1)的交叉反应(CR%)为51.82%,与石房蛤毒素(STX)无交叉反应。结果表明,建立了OA间接竞争ELISA检测方法,可用于海产品中OA残留检测。

腹泻性贝类毒素大田软海绵酸液态芯片检测方法的建立

利用间接竞争法免疫学原理,以自制的大田软海绵酸(okadaic acid,OA)与卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)的偶联物OA-OVA包覆微球为载体,同时自制生物化抗OA单克隆抗体,利用液态芯片(Luminex Xmap 200TM)系统建立OA液态芯片定量检测方法;同时测定了方法的灵敏性和特异性,并对贝类模拟样本进行了测试。结果显示:液态芯片法对OA的检测线性范围为0.2～63μg/L,最低检测值为0.129μg/L,均优于酶联免疫吸附法;除与DTX-1的交叉反应率为54.2%外,与其他几种用于检测的贝类毒素没有任何交叉现象;在加标浓度为6.25～400μg/L时,回收率为84.96%～90.35%,变异系数为3.20%～6.59%。因此,该方法可满足海产品中贝类样品OA限量标准检测。