典型城市屠宰及销售猪肉中弓形虫的分子检测研究

为了解我国重庆市、广州市和上海市3个典型城市屠宰环节和销售环节猪肉中弓形虫的携带情况,在这3个城市共采集猪膈肌样品393份,分别进行胃蛋白酶消化并提取基因组DNA,以弓形虫529 bp重复序列为目的基因,进行PCR扩增。结果显示,3个城市猪膈肌肉中弓形虫的阳性率为5.34%,其中重庆市的阳性率最高,达9.83%;其次是上海市,为3.17%;而广州市则未检出阳性样品。夏季和秋季间、屠宰环节和销售环节间的阳性率差异均不具备显著统计学意义。本研究结果为减少弓形虫对上述地区人群的危害,预防和控制弓形虫病流行,指导猪群的饲养管理以及提高畜牧业经济效益提供了有益指导。

宁夏牛隐孢子虫感染情况调查研究

为了解宁夏地区牛隐孢子虫感染情况,在宁夏5个地级市中的10个县(区)随机抽取10个规模牛场,采集牛粪便样品600份,用牛隐孢子虫抗原检测试剂盒进行ELISA检测。结果显示,在600份样品中,有157份样品隐孢子虫阳性,阳性率为26.17%。其中奶牛的阳性率为10.42%,肉牛的阳性率为36.67%,两者差异极显著(P<0.01)。不同地区牛的隐孢子虫阳性率不同,其中奶牛的阳性率在1.67%~23.33%之间,肉牛的阳性率在16.67%~63.33%之间,均差异极显著(P<0.01)。不同年龄阶段牛的阳性率也不同,育成奶牛、成年奶牛以及成年肉牛的阳性率较高,分别达11.25%、11.25%和41.67%。该研究首次采用牛隐孢子虫抗原检测试剂盒对宁夏5个市的规模养殖牛场进行检测,为深入了解该地区牛隐孢子虫流行情况、制定有效的防控措施提供了依据。

隐孢子虫三种实时荧光定量PCR检测方法的比较

为筛选一种检测谱广、敏感性好、特异性高的隐孢子虫实时荧光定量PCR法,对JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法三种隐孢子虫实时荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性进行了检测,并与基于18S r DNA序列的套式PCR方法进行了比较。结果显示,以10倍倍比稀释的含有微小隐孢子虫18S r DNA基因片段的重组质粒为模板,成功地建立了三种实时荧光定量PCR方法;敏感性试验显示,JVAP18S法和Csp18S法最低可检测0.1个卵囊,而CRU18S法最低只能检测到1个卵囊,但他们均比套式PCR方法敏感;特异性试验结果显示,三种实时荧光定量PCR法均可检测微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)和贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi),而其他属寄生虫和细菌DNA的检测结果均为阴性;重复性试验结果显示,JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法的批内变异系数分别为0.69%~2.68%、0.11%~4.93%、0.04%~2.89%,批间变异系数分别为0.52%~5.75%、2.09%~5.13%、1.15%~3.71%;对50份小鼠田间粪便样品检测结果显示,JVAP18S法检测的阳性率为84.00%,显著高于套式PCR法检测的64.00%的阳性率。上述结果表明,三种实时荧光定量PCR法均能有效检测隐孢子虫,比较而言,JVAP18S法敏感性高、特异性强、重复性好,尤其适合于隐孢子虫含量较少的样品检测。

刚地弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D的生物信息学分析

目的预测刚地弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列(Toxoplasma gondii surface antigen glycoprotein 1-related sequences)SRS47D的结构、修饰位点和免疫原性。方法利用在线软件ProtParam、ProtScale、SignalP分别预测SRS47D的理化参数、亲/疏水性、信号肽;利用SOPMA、ESPriit 3.0、Bcepred预测SRS47D蛋白的二级结构及表面可极性,利用COLIS、TMHMM预测其卷曲螺旋和跨膜结构域;利用KinasePhos、NetOGlyc、NetNGlyc、NetCGlyc、和NetPhos分析其修饰位点;利用SWISS-MODEL、VAST预测其三级结构及其与SAG1三级结构的差异,利用ABCpred和Syfpeithi预测其B、T细胞表位。结果 SRS47D蛋白含有376个氨基酸残基,分子式为C1745H2797N469O587S17,相对分子质量约为40×103,理论等电点为4.96;疏水值为71.60,总平均亲水性为-0.405。在SRS47D蛋白的二级结构中,α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为23.14%、19.68%、2.39%和54.79%。SRS47D蛋白具有信号肽序列,无跨膜结构区,具有18个亲水区域(临界值为1.9)、8个柔性区域(临界值为2)和17个表面可及性区域(临界值为1.9)。SRS47D蛋白翻译后修饰位点中包含两个糖原合成酶激酶位点和两个O-GlcNAc糖基化位点,无N-GlcNAc和C-GlcNAc糖基化位点。与弓形虫表面抗原糖蛋白1(SAG1)蛋白三级结构比对,SRS47D在β折叠处存在重叠。ABCpred和Syfpeith预测SRS47D蛋白有24个限制性CTL细胞表位、13个限制性Th细胞表位和10个B细胞抗原表位。结论 SRS47D蛋白含丰富的B、T细胞表位,免疫原性好,可能成为弓形虫病疫苗候选分子。

异尖科线虫线粒体基因组序列的生物信息学分析

目的了解异尖科线虫线粒体基因组序列特性及其在分子分类和系统进化研究中的价值。方法从NCBI网站获得5种异尖科线虫的线粒体基因组序列数据,应用ClustalW、MEGA7、ARWEN进行核苷酸与编码氨基酸比对;利用ESPript和PyMOL软件分析COX1蛋白一级结构,比较各蛋白三级结构模型。结果异尖线虫科线粒体DNA为双链闭环分子,长度为1.32～1.40kb。共有36个以相同方向排列的基因,其中编码蛋白质的基因12个,编码tRNA的基因22个(含亮氨酸-tRNA和丝氨酸-tRNA基因各2个,其余18种氨基酸tRNA各1个),编码rRNA的基因2个(分别为16S核糖体RNA(rRNA)和12SrRNA)。在12个蛋白编码基因中,CYTB和Nad2基因进化速率快,而cox1和nad4L基因则保守。线粒体tRNA长度为52～65bp,数目在6～9个之间,其中布兰地线虫(A.berlandi)的tRNA数目较多,为9个,而对盲囊线虫(C.ogmorhini)和简单异尖线虫(A.simplex)均为6个。tRNA二级结构多为经典的三叶草结构,少数为D-loop结构。简单异尖线虫与派氏异尖线虫(A.pegreffii)亲缘关系较近,拟地新线虫(P.decipiens)和简单异尖线虫与派氏异尖线虫的亲缘关系较远,对盲囊线虫与以上各虫种的亲缘关系较远。编码蛋白序列同源性比对显示,对盲囊线虫的COX1与其他4种异尖线虫差异较大,有17个氨基酸与其他4种不相同。氨基酸序列三级结构比对显示,对盲囊线虫的COX1有两处位点的折叠与其他线虫存在差异。结论异尖科线虫线粒体基因组分布均一,排列紧密,种间编码的蛋白质序列差异较小。A.pegreffii和A.simplex与A.berlandi的同源性较高,COX1可以作为异尖科线虫中重要的标志性蛋白。

山东省滕州市羊隐孢子虫感染检测与其actin序列分析

为了解山东省滕州市羊隐孢子虫感染情况和种类,从该市2个绵羊场、2个山羊场采集222份羊粪便样品,提取所有样品的基因组DNA,采用巢式PCR扩增隐孢子虫actin基因,对阳性样品进行序列测定和分析。结果显示,滕州市羊隐孢子虫总的感染率为6.76%,其中绵羊7.84%,山羊5.83%;不同月龄的羊感染情况不同,6~12月龄绵羊感染率最高(20.69%),而12月龄以上的山羊感染率最高(10.00%);共发现3种隐孢子虫感染,其中微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum,C.parvum)检出率最高为53.33%,其次是肖氏隐孢子虫(C.xiaoi)为40.00%,仅发现1例(6.67%)泛在隐孢子虫(C.ubiquitum)感染;序列比对结果显示,本试验所获得基因序列与Gen Bank中的C.parvum、C.xiaoi、C.ubiquitum actin基因序列同源性达到100%;系统进化分析显示,滕州市的羊样品中鉴定的actin序列,与Gen Bank中的相应虫种序列在同一分支上。研究结果为深入了解滕州市羊隐孢子虫流行情况及制定有效的防控措施提供了依据。

猪附红细胞体HspA1与DnaJ相互作用的双分子荧光互补的研究

为研究猪附红细胞体DnaK样蛋白HspA1与DnaJ是否存在相互作用,采用双分子荧光互补技术进行检测。利用生物信息学软件预测HspA1的B细胞抗原表位和功能结构域,选取具有功能结构域且抗原表位富集的第388-609位区域为HspA1表位区。分别对HspA1编码基因a1、HspA1表位区编码基因a1-epi进行扩增,并克隆到pBiFC-VC155载体中,同时将DnaJ编码基因dnaj克隆到pBiFC-VN155中,分别与上述重组质粒共转染293T细胞。结果显示,成功地构建了含HspA1编码基因a1、HspA1表位区编码基因a1-epi、DnaJ编码基因dnaj的真核重组表达质粒pBiFC-VC155-a1、pBiFC-VC155-a1-epi和pBiFC-VN155-dnaj,共转染的293T细胞在荧光显微镜下均能观察到绿色荧光,表明HspA1和HspA1表位区均与DnaJ存在相互作用。本研究为进一步探讨HspA1的生物学功能和作用机制提供了新的思路。

弓形虫Ⅰ型蛋白磷酸酶基因的原核表达及蛋白的定位研究

为表达刚地弓形虫Ⅰ型蛋白磷酸酶(Toxoplasma gondii protein phosphatase 1,Tg PP1)基因、确定Tg PP1在弓形虫速殖子上的定位,将全基因合成的Tg PP1基因克隆到表达载体p ET-30a(+)中,构建重组载体p ET30a-Tg PP1,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导,利用SDS-PAGE和Westernblot检测重组蛋白表达情况及其免疫学活性。通过亲和层析获得Tg PP1重组蛋白,制备抗血清,采用间接ELISA检测血清效价、免疫荧光法检测Tg PP1蛋白在弓形虫中的定位。结果显示,成功构建了重组表达载体p ET30a-Tg PP1并实现了在大肠杆菌中的表达,表达产物的分子质量约为36 ku。Western-blot检测结果显示,重组蛋白能与弓形虫感染小鼠阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。免疫荧光检测结果显示,Tg PP1主要定位于弓形虫速殖子顶端。上述结果为进一步研究Tg PP1在弓形虫入侵和繁殖过程中的作用及其机制打下了基础。

微小隐孢子虫P23基因真核表达质粒在HeLa细胞中的表达及其免疫小鼠血清抗体效价的检测

为观察微小隐孢子虫P23基因真核重组质粒在He La细胞中的表达及免疫小鼠血清抗体产生情况,通过设计特异性引物,利用PCR技术,对微小隐孢子虫卵囊基因组DNA进行P23基因扩增;将扩增产物插入真核表达载体p VAX-1中,构建重组真核表达质粒p VAX1-P23,转染He La细胞,运用间接免疫荧光法及Western-blot技术,验证重组质粒在He La细胞中的表达情况;将重组质粒p VAX1-P23免疫小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清特异性抗体产生情况。结果显示,成功地扩增了长度约为336 bp的微小隐孢子虫P23基因;双酶切和序列测定结果显示,构建的真核重组表达质粒p VAX1-P23中外源基因序列和插入位置正确;间接免疫荧光法及Western-blot分析显示,p VAX1-P23真核重组表达质粒在He La细胞中被成功表达;小鼠免疫重组质粒2周后,即可检测到抗体产生,直至第8周试验结束。结果表明成功地构建了真核重组表达质粒p VAX1-P23,该重组质粒能在He La细胞和小鼠体内表达,并诱导小鼠产生显著的体液免疫反应,为进一步开展隐孢子虫P23蛋白特性研究、研制抗隐孢子虫病核酸疫苗奠定了基础。

新疆新源县多房棘球蚴病病例特征及其病原基因多态性分析

目的了解新疆新源县人群多房棘球蚴病(AE)病例特征及其病原基因多态性情况,为制定AE预防控制策略提供参考。方法收集2016—2020年新疆医科大学第一附属医院生物样品库中新源县AE患者的病例信息及其手术切除的肝脏病灶样品,提取肝脏病灶样品基因组DNA,PCR扩增线粒体NADH脱氢酶2(nad2)基因并测序,PCR产物经测序剪接后进行BLAST比对,用MEGA10.0软件采用邻接法构建系统进化树,DnaSPv5软件分析扩增序列的基因型,Network10.0软件制作nad2基因型网络图。结果共收集AE病例28例,其中农区7例,巩乃斯河两岸流域21例;男性17例,女性11例,二者差异无统计学意义(χ^(2)=0.704,P>0.05);民族分布中,汉族12例、哈萨克族11例、维吾尔族3例、蒙古族1例、其他民族1例;职业分布中以农牧民为主,占92.86%(26/28),其他职业仅占7.14%(2/28),不同职业间病例数差异有统计学意义(χ^(2)=3.89,P<0.05);年龄分布中以20~49岁年龄组为主,占78.57%(22/28),其他年龄组占21.43%(6/28),不同年龄组间病例数差异无统计学意义(χ^(2)=0.418,P>0.05)。25份多房棘球蚴肝组织病灶样品PCR扩增出大小约1031 bp的片段,与预期大小一致,另3份未扩增出条带。序列比对结果显示,25条序列分属H1、H2、H3和H4等4个基因型,其中H1为主要基因型(占72.0%,18/25),与哈萨克斯坦(GenBank登录号AB461406)分离株序列一致性为100%。系统进化树结果显示,新源县病例分离株的4个基因型与波兰(GenBank登录号KY205700)和哈萨克斯坦(GenBank登录号AB461406)分离株在同一条分支上,但与法国(GenBank登录号AB461404)、奥地利(GenBank登录号AB461403)、加拿大(GenBank登录号JF751036)、美国阿拉斯加(GenBank登录号MT429275)、美国印第安纳(GenBank登录号AB461409)及中国内蒙古(GenBank登录号AB461411)分离株亲缘关系较远。基因型网络图结果显示,以H1为中心,H2、H3、H4、中国四川,波兰、加拿大及日本分离株呈散射状分布,表明这些分离株均与H1亲缘关系较近,但与法国、奥地利、加拿大,美国阿拉斯加等序列不在同一分支,亲缘关系较远。结论本研究分析的28例AE患者主要为汉族和哈萨克族,农牧民占比较高,AE患者样品共有4个基因型,其中H1属新源县主要基因型。