畜禽球虫生物学与球虫病防治研究——记上海兽医研究所四十年研究回顾

为全面了解中国农业科学院上海兽医研究所(原中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所、中国农业科学院上海家畜血吸虫病研究所)在畜禽球虫生物学与球虫病防治研究方面取得的进展,本文从球虫的流行病学调查、虫种分离鉴定、诊断技术、药物防治、抗药性检测、免疫预防、体外培养、分子生物学等方面,介绍了上海兽医研究所近40年开展的主要工作和取得的研究结果,并提出了今后的重点研究方向。

寄生虫乳酸脱氢酶研究进展

大多数体内寄生虫的生存必须依赖糖酵解途径将葡萄糖代谢为乳酸以提供能量。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)是糖酵解途径的末端酶,催化丙酮酸还原为乳酸及乳酸氧化为丙酮酸的可逆反应,与寄生虫生存密切相关。研究表明,各种寄生虫LDH在理化性质和分子结构方面均有独特的特性,是良好的诊断分子和潜在的药物作用靶标。对寄生虫LDH功能的研究,对于促进寄生虫病诊断、疫苗研究以及新抗虫药物的研发具有重要意义。本文对国内外寄生虫LDH的研究现状进行了综述。

中国畜禽寄生虫查询系统与开放接口的建立

随着互联网的发展,网络移动端和PC端的普及,互联网在信息获取中所占的比重不断增长。在畜禽寄生虫分类领域,至今还没有信息较为完整的查询系统可以在网上使用。通过采集《中国家畜家禽寄生虫名录(第二版)》、《中国畜禽寄生虫形态分类图谱》和《中国畜禽线虫形态分类彩色图谱》等系列书籍,作为数据库的信息来源,建立中国畜禽寄生虫数据库。在数据库和需求分析的基础上,开发了中国畜禽寄生虫查询系统,根据功能定义分为4大子系统,分别为搜索系统(核心)、前台系统(页面、用户)、管理系统、单点登录系统。该系统使用Java作为开发语言,应用了Spring、SpringMVC、Mybatis框架,使用Redis作为系统缓存、Solr作为虫种形态搜索服务。该系统的开发也是全文检索技术在寄生虫信息检索领域的首次应用,通过记录用户访问的数据,来完善虫种地区访问的记录,为虫种鉴定提供更多的数据支撑。

上海市大王蛇、赤练蛇感染寄生虫情况初步调查

为初步了解上海市场蛇寄生虫的感染情况,剖检了来自上海市场罚没的2种19条蛇,其中赤链蛇(Dinodon rufozonatum)9条、大王蛇(Elaphe carinata)10条,分别取血液涂片,依序检查体表、皮下、肌肉、心脏、肺脏、肝脏、胃、肠道等组织器官,收集检获的寄生虫,显微镜初步观察.结果显示:在19条蛇均未检出外体寄生虫、吸虫和棘头虫,在皮下和体内检出线虫和绦虫,在血液中检出肝簇虫(Hepatozoon),蛇的寄生虫感染率为100%.线虫、绦虫、肝簇虫在赤链蛇的检出率分别为77.88%、100%、0,在大王蛇的检出率全部为100%.从19条蛇共检获线虫192条、绦虫(裂头蚴)1236条,其中69.79%的线虫和86.55%的绦虫来自大王蛇.按检出的脏器统计,93.20%的绦虫来自皮下与肌肉,65.63%的线虫来自胃.调查结果表明,上海市场两种蛇的寄生虫感染率高、感染强度大,其中检出的裂头蚴为人畜共患寄生虫,吃蛇皮与蛇肉、吞蛇胆存在感染寄生虫的极大风险.因此,保护蛇类等野生动物,也是保护人类自身.

上海市部分鸟类寄生虫虫卵检查情况

为调查上海市部分鸟类寄生虫感染情况,于2012年2、5、8、11月分别对上海市部分鸟类粪便进行采集,共抽样采集46种鸟类的231个粪样,采用漂浮法、沉淀法和麦氏虫卵计数法调查其寄生虫虫卵的感染率及感染强度。结果显示:有39种鸟的171个粪样检出寄生虫虫卵阳性,粪便中的寄生虫虫卵以球虫卵囊和线虫卵为主。5月和8月寄生虫虫卵的检出率相对较高。球虫卵囊和线虫卵的每克粪便卵囊数(OPG/EPG)最大值均出现在11月,分别为168 750个和3375个。检查结果表明,上海花鸟市场鸟类感染寄生虫的种类较多,感染率高。检查结果为掌握上海鸟类寄生虫的感染状况和做好寄生虫病的防控提供了基础数据。

日本血吸虫感染不同相容性动物宿主的比较研究

目的了解日本血吸虫感染不同动物宿主(包括天然宿主和实验动物宿主)后的虫体发育和宿主组织病理变化差异。方法以黄牛、水牛、山羊、BALB/c小鼠、Wistar大鼠和新西兰大白兔为对象,同一时间人工感染相同来源的日本血吸虫尾蚴,收集感染后相同日龄的虫体(49d),对虫体发育进行比较,对宿主的肝脏病变进行比较,并对黄牛、水牛和山羊的肝脏进行了病理切片的观察和比较。结果不同动物宿主来源的虫体的长度、宽度和发育情况存在着差异,总体来说是适宜宿主体内的虫体长度明显长于非适宜宿主体内的虫体长度,雌虫长于雄虫(Wistar大鼠来源的虫体例外)。发育情况除了Wistar大鼠来源的虫体未发育成熟,其余动物来源虫体均发育成成虫。6种动物宿主的肝脏病变存在很大的差异,适宜宿主感染后肝脏布满虫卵结节,病变尤其严重;而非适宜宿主的肝脏只有少量虫卵结节(水牛),或者几乎看不到虫卵结节(Wistar大鼠)。天然宿主肝脏病理观察发现,黄牛组和山羊组肝脏组织炎性细胞明显增多且聚集,虫卵周围有大量嗜酸性细胞浸润,多量炎性淋巴细胞聚集浸润,形成典型条纹状嗜伊红沉淀物;而水牛组的肝细胞无变性、无炎症细胞的聚集浸润,小叶结构完整。结论日本血吸虫对黄牛、山羊、BALB/c小鼠和新西兰大白兔的易感性高于水牛和Wistar大鼠,对前4种动物的致病性也强于后2种,本文为进一步了解日本血吸虫对不同终末宿主的感染差异提供了一些参考数据。

广西地区人工驯繁猕猴、食蟹猴胃肠道寄生虫感染情况的初步调查

目的了解广西人工驯养、自繁非人灵长类实验动物（猕猴、食蟹猴）胃肠道寄生虫感染情况，为制定防治策略提供参考依据。方法根据驯繁场的常规饲养管理设置，将猴群分为生长猴群、繁殖猴群、检疫猴群三类，于2008～2012年间采集广西区内六家驯繁场共784份粪样，同时采用直接涂片法、饱和食盐水漂浮法、醛．醚沉淀法对粪样进行处理后镜检。结果猴胃肠道寄生虫总感染率为72．4％。共检查出原虫5类分别为：阿米巴原虫、人毛滴虫、贾第虫、结肠小袋纤毛虫及球虫：线虫5类分别为：鞭虫、类圆线虫、泡翼线虫、食道口线虫、卷口线虫；绦虫2类分别为膜壳绦虫、司氏伯特绦虫；以及吸虫1类、粉螨1类。生长猴群感染胃肠道寄生虫的种类最少，检疫猴群感染种类多，繁殖猴群则介于两种猴群之间。其中生长猴群与繁殖猴群肠道原虫的感染率相对较高，以阿米巴原虫与结肠小袋纤毛虫的感染为主。结论此次调查结果显示生活史简单的原虫以及驱虫药驱杀效果不佳的土源性线虫已成为危害广西驯繁非人灵长类实验动物的主要虫种，可作为防控依据：而部分检出虫种可作为人兽共患寄生虫病病原体，因此在防范人与猴群之间的疾病传播中具有重要的公共卫生意义。

上海市部分鸟类寄生蠕虫感染情况调查

为了解上海市鸟类寄生虫感染现状,于2012年从上海市部分花鸟市场分批购买了11科21种103只鸟,采用完全剖检法对鸟类消化道及各脏器进行寄生虫检查。结果显示,有14种33只鸟检出蠕虫,鸟种类的蠕虫感染率为66.67%(14/21),鸟个体的蠕虫感染率为32.04%(33/103),其中黄鹂、灰背鸫、灰喜鹊、丝光椋鸟、喜鹊、野鹌鹑等6种鸟的检出率较高,感染率为60%～100%。在检出蠕虫的14种33只鸟中,共检获蠕虫932条,其中从9种16只鸟检获吸虫268条,从8种17只鸟检获绦虫631条,从7种12只鸟检获线虫17条,从4种7只鸟检获棘头虫16条。在检获的932条蠕虫,分别来自肺脏、肾脏、肝脏(胆囊)、肠道,而在心脏、气管、胃、皮下等组织器官未检出蠕虫。肠道是寄生虫寄生的主要场所,从27只鸟的肠道检获746条蠕虫,分别占阳性鸟和蠕虫数的81.82%(27/33)、80.04%(746/932);其次为肝脏(胆囊),从8只鸟的肝脏(胆囊)检获182条蠕虫,分别占阳性鸟和蠕虫数的24.24%、19.53%。在感染强度上,野鸽子和乌灰鸫的蠕虫感染强度最高,平均每只分别检出171条和123条,其次为灰背鸫(53条/只)。调查结果表明,上海市鸟类寄生虫的种类多,且蠕虫的各大类(吸虫、绦虫、线虫、棘头虫)均有检出,依据检获的虫体数量,绦虫和吸虫是鸟类的主要寄生虫,调查结果为初步掌握上海市鸟类寄生虫的感染现状、做好鸟类寄生虫病的防控提供了基础数据。

上海市市售青蛙寄生蠕虫感染情况初步调查

为了解上海市市售青蛙蠕虫的感染情况,对52只黑斑蛙(Rana nigromaculata)进行剖检,按脏器检查、收集寄生虫虫体,统计寄生虫的感染率与感染强度。结果显示,青蛙蠕虫感染率为90.38%,平均感染强度为20.21条。不同种类寄生虫的感染情况明显不同,线虫、吸虫、绦虫和棘头虫的感染率分别为50.00%、86.54%、17.31%和51.92%,感染强度分别为3.38、15.00、5.11和5.22条。不同脏器寄生虫的感染情况不同,肠道的寄生虫感染率最高,为90.38%;肠道、肌肉与皮下寄生虫的感染强度分别为15.34和11.38条,明显高于其他器官。不同种类寄生虫的寄生虫部位明显不同,线虫、吸虫和棘头虫主要来源于肠道,绦虫主要来源于肌肉与皮下。通过对检出虫体的形态进行初步观察,吸虫、线虫、绦虫和棘头虫种类分别约有6、3、1和2种,但具体种类尚需进一步鉴定。本调查结果为掌握上海市市售青蛙寄生虫感染状况和做好寄生虫病防控提供了基础数据。

细胞渗透肽在动物医学领域的应用

随着疫苗及药物的发展,新型传递系统的研究和应用日益受到关注。细胞渗透蛋白或肽(CPPs)作为一种传递系统,具有穿过哺乳动物细胞膜的能力,且不受能量和受体的约束。细胞渗透肽已经成功地携带多肽、荧光标记蛋白、螯合剂、DNA、反义核酸、脂质体等物质,实现体内外的跨膜递送,并可导入几乎所有的组织和细胞内。细胞渗透肽作为转运载体在药物传递、治疗性分子转运和疫苗增效方面都显示了重要价值,已成为国内外相关研究的一个热点。论文对细胞渗透肽的种类和在动物医学方面的应用做了综合性的概述,以此促进细胞渗透肽能在将来的动物医学方面有更广阔的应用前景。

日本血吸虫(中国大陆株)Cathepsin L基因的克隆、表达及其免疫保护功能的研究

目的开展日本血吸虫组织蛋白酶L(SjCL)功能研究,为研发血吸虫病抗病疫苗提供基础。方法应用RT-PCR技术分离、克隆日本血吸虫中国大陆株组织蛋白酶L保守功能域编码基因,并在大肠杆菌系统中表达,应用免疫亲和层析法纯化组织蛋白酶L重组抗原,用该基因纯化重组表达产物进行小鼠免疫保护实验。结果获得了672 bp的血吸虫组织蛋白酶L保守功能域cDNA序列,成功构建了原核表达载体pET28a(+)-SjCL,并在大肠杆菌中进行了表达,经免疫亲和层析获得了高纯度的SjCL融合蛋白,以该纯化物免疫小鼠,结果实验组减虫率为36.04%,肝组织减卵率为34%,粪卵减少率达49%,与对照组进行方差分析,差异均显著。结论获得日本血吸虫组织蛋白酶L保守功能域cDNA克隆,其原核表达产物免疫小鼠对抗血吸虫感染具有一定的保护性。

细胞渗透肽在动物医学领域的应用

随着疫苗及药物的发展，新型传递系统的研究和应用日益受到关注。细胞渗透蛋白或肽（CPPs）作为一种传递系统，具有穿过哺乳动物细胞膜的能力，且不受能量和受体的约束。细胞渗透肽已经成功地携带多肽、荧光标记蛋白、螯合剂、DNA、

柔嫩艾美耳球虫微管蛋白β链基因EtTBC的克隆、表达及特性的初步分析

鸡球虫病是一种由艾美耳属原生动物寄生虫引起的肠道疾病,是影响家禽业的最重要疾病之一。目前,球虫病的控制主要依赖于抗球虫药物的使用,但由于药物的长期广泛使用导致了球虫的严重耐药性。为研究其耐药性机制,本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株、盐霉素耐药株进行了转录组测序分析,发现与敏感株相比,柔嫩艾美耳球虫微管蛋白β链(Et TBC)仅在地克珠利耐药株高表达。本研究在此基础上,克隆、表达了EtTBC,并初步分析了其功能及与地克珠利的关系;以柔嫩艾美耳球虫敏感株cDNA为模板成功克隆了EtTBC基因,构建了原核表达重组质粒pET28a-Et TBC,并成功诱导表达了重组蛋白r Et TBC;利用qPCR对柔嫩艾美耳球虫敏感株不同发育阶段以及不同虫株(耐药株、敏感株和田间耐药株)的mRNA转录水平进行了分析,结果显示,该基因的转录水平在敏感株未孢子化卵囊阶段最高,且其mRNA转录水平仅在地克珠利耐药株上调;间接免疫荧光定位结果表明该蛋白主要分布在子孢子除折光体外的细胞质和表面,第二代裂殖子的细胞质和表面。

巴贝斯虫病研究进展

巴贝斯虫病是一种由寄生于红细胞内的巴贝斯虫引起的人兽共患病,主要通过硬蜱进行传播。致病机理主要是染虫红细胞裂解导致溶血性贫血,在特殊情况下会进一步导致器官衰竭甚至死亡。对该病的诊断方法主要有血涂片观察、动物接种、ELISA检测及核酸诊断等。该病的主要治疗方法为克林霉素和奎宁联用,另外,阿托伐醌与阿奇霉素联用在一些病例中展现了良好的治疗效果。现阶段对该病的预防措施主要为消灭硬蜱,加强公众对蜱的防范意识,同时由于该病能通过输血途径在人群中传播,因此有必要对输血人群进行血液检测,以减少人群感染的概率。

堆型艾美耳球虫早熟株免疫剂量研究

为确定堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)早熟株合适的免疫剂量,设立7个早熟株免疫攻虫组、7个母株免疫攻虫组、1个不免疫攻虫组和1个不免疫不攻虫组,7个早熟株/母株免疫组的免疫剂量为孢子化卵囊100、200、400、600、800、1 000、2 000个/羽,经嗉囊感染,7日龄首次免疫,14日龄以同等剂量进行第二次免疫,21日龄以1.5×105个/羽的同源母株进行攻虫,28日龄结束试验,以增重、肠道病变记分和卵囊减少率为试验指标。并对早熟株中免疫保护效果较好的2个免疫剂量进行重复试验,免疫方法、试验周期、试验指标同第一批试验,攻虫剂量为2×105个/羽的同源母株。结果显示,免疫期间,各免疫组的增重与不免疫组差异不显著(P>0.05);攻虫期间,早熟株400、600、800、1 000个/羽和母株600、800、1 000个/羽免疫组的相对增重与不免疫不攻虫组差异不显著(P>0.05);肠道病变记分,除2 000免疫组明显低于不免疫攻虫组(P<0.05)外,其余各免疫组虽低于不免疫攻虫组,但与其差异不显著(P>0.05);卵囊减少率,早熟株和母株400～2 000个/羽免疫组均达90%以上,其中600、800个/羽免疫组达97%以上。用早熟株600、800个/羽进行免疫重复试验,两个免疫组攻虫期间的相对增重和肠道病变记分均与不免疫不攻虫组差异不显著(P>0.05),而与不免疫攻虫组差异显著(P<0.05),其卵囊减少率均在88%以上。研究结果表明,该堆型艾美耳球虫早熟株保持了良好的免疫原性,不同免疫剂量均能诱发鸡产生免疫保护力,其中以600、800个/羽的免疫效果更好,可考虑以600个/羽作为该早熟株在疫苗制备中的推荐免疫剂量。

顶复门原虫棒状体蛋白ROP18的研究进展

顶复门原虫是一类专性的细胞内寄生原虫,包括刚地弓形虫、隐孢子虫、疟原虫、巴贝斯虫和球虫等,是人和动物的重要病原。这类原虫具有相似的亚细胞结构并能分泌与入侵相关的保守蛋白,尤其是在入侵宿主细胞阶段分泌的棒状体蛋白(rhoptry proteins,ROPs)被认为是保护寄生虫入侵和繁殖的关键分子。其中ROP18是具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的ROP2家族蛋白成员之一,在刚地弓形虫入侵宿主细胞阶段发挥重要作用,是纳虫空泡(PV)形成时宿主细胞免疫的抑制因子。随着基因组学和蛋白质组学技术的不断发展,其相关研究也越来越深入。本文以目前研究最多的刚地弓形虫ROP18为主,对其发现历史、结构、分泌及定位、对宿主的毒力机制及应用现状做一综述。

扫描电镜观察猴体内寄生的蛇舌状虫属若虫及基于其18S rRNA基因的种系发育关系分析

目的运用扫描电镜观察食蟹猴(Macaca fascicularis)体内分离的蛇舌状虫属若虫虫体表面的超微结构,并基于其18S rRNA序列分析其分子种系发育关系。方法将从食蟹猴分离的蛇舌状虫属若虫用戊二醛与锇酸双固定法,置于扫描电镜下观察其体表超微结构。PCR扩增若虫18S rRNA基因并测序;运用序列比对软件ClustalX 1.83将测序结果与GenBank上所有已登录的孔头舌虫目(Porocephalida)内部虫种序列进行多重比对分析,并使用MEGA 4.0采用邻位相连法构建种系发育树进行分析。结果扫描电镜示,若虫呈圆柱状,前段略粗,末端变细。腹环由前向后逐渐增宽,至12～13腹环时趋于等宽,腹环与腹环之间,在前半段连接紧密,在后半段有一定间隔。头部腹面正中为口,呈圆形,口稍上方两侧各见一对钩,钩几乎在同一平行线上。两外侧钩的正下方,头胸部最后一节胸环上各有一个对称的大型感觉乳突,紧接的第一节腹环靠中线处有一对呈对称的大型感觉乳突,腹环数目由此算起共29个腹环(末端有2个腹面未连接的不完整腹环不计算在内)。若虫全身布满类圆形的感觉乳突,但在头部背面与末节腹面未见有此类乳突出现。末端腹面有一块状隆起上可见肛门开口。参照文献,暂将该若虫定为串珠蛇舌状虫(Armillifer moniliformis)的若虫。PCR测序后获得18S rRNA部分基因序列,长度为1 836 bp,提交GenBank后获得登录号为HM048870。种系发育树显示其与尖吻蝮蛇舌状虫(A.agkistrodontis)和腕带蛇舌状虫(A.armillatus)构成自展值为95%的分支。前两者又构成一个独立的自展值为75%的分支。结论自食蟹猴体内分离的蛇舌状虫属若虫暂定为串珠蛇舌状虫若虫。

鸡堆型艾美耳球虫新基因的克隆与生物信息学分析

试验旨在对堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）孢子化卵囊新基因EST序列进行克隆与生物信息学分析。通过RACE技术扩增从E．acervulina cDNA表达文库中筛选获得的EST序列，得到EST全长cDNA序列，利用多种生物信息学分析软件对其编码蛋白进行分析和预测。结果表明，该EST序列为E．acervulina孢子化卵囊阶段新基因，GenBank登录号为EU590120；该基因含1个492 bp的开放阅读框，编码163个氨基酸，理论分子质量为17．049 ku，等电点为6．69，酸性氨基酸8个，碱性氨基酸8个，分子式为C761H1223N199O219S12总平均亲水性（GRAVY）为0．731；该蛋白有信号肽，为分泌性蛋白；具有4个跨膜结构，在105～115、28～32和132～138位之间有很强的疏水性；具有1个蛋白激酶C磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N端豆蔻酰基化位点。因此根据生物信息学全面预测和分析，发现该基因所编码的蛋白具有较多的生物学功能位点和潜在的抗原表位区域。

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3在293T细胞中的表达研究

为构建柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenella calcium-dependent protein kinases 3,EtCDPK3)基因的重组质粒pCAGGS-EtCDPK3,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其含完整开放阅读框的序列,将其克隆至pGEM-T easy载体,构建pGEM-Teasy-EtCDPK3重组质粒,双酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3。该重组质粒经酶切和测序鉴定正确后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtCDPK3基因的表达情况。结果显示所构建的真核重组表达质粒pCAGGSEtCDPK3经过双酶切鉴定,可见1条大小约为1302 bp的目的条带,测序结果与实验室已获得的EtCDPK3序列完全一致;Western blot结果可见大小约为49 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到红色荧光。这些研究结果表明已成功构建了EtCDPK3的真核重组表达质粒pCAGGS-EtCDPK3,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtCDPK3的功能和制备DNA疫苗奠定了基础。

犬隐孢子虫病研究进展

犬隐孢子虫(C.canis)广泛寄生于犬体内,也可感染人,引起犬和人的隐孢子虫病(Cryptospo-ridiosis)。近年来,随着其生物学特性及流行病学研究的深入,犬隐孢子虫逐渐引起了人们的重视。论文从病原学、寄生部位与致病性、流行病学、诊断和防治等方面阐述了犬隐孢子虫病的研究现状,为有效防治该病提供参考。