新城疫病毒毒力分子机制研究进展

新城疫是由新城疫病毒引起的一种能够感染多种鸟类的烈性传染病,尤其对鸡、鹅等常见家禽具有高度的传染性和致死性。NDV属于副黏病毒科副黏病毒亚科禽腮腺炎病毒属,为囊膜包裹的、不分节段的、单股负链RNA病毒。NDV只有一个血清型,根据其长度分为Class I和ClassⅡ2大系谱。NDV基因组含有6个开放式阅读框,分别编码核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素-神经氨酸蛋白和大蛋白。此外,在P基因转录过程中,NDV通过RNA编辑机制编码额外的2种非结构蛋白质,即V和W。鉴于新城疫病毒的广泛传播性和高度的致死性,本文着重从NDV毒力的评价指标、NDV的侵入机制与毒力、NDV的复制与毒力、NDV免疫逃避机制与毒力、NDV非编码区基序与毒力5个方面来阐述,以期为深入研究不同毒株间的致病性差异以及进一步防控新城疫病毒奠定基础。

Ⅰ型鸭肝炎病毒内部核糖体进入位点的结构与功能研究

为验证Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组5'非编码区(UTR)是否含有内部核糖体进入位点元件,本研究利用体外翻译系统,结合细胞转染试验对DHV-Ⅰ5'UTR的结构和功能进行分析。结果表明:DHV-Ⅰ的5'UTR具有典型的内部核糖体结合元件(IRES)功能,能够内部起始下游蛋白的翻译,IRES元件位于360 nt～620 nt,共260个碱基。对IRES的二级结构进行预测和分析显示,DHV-ⅠIRES的结构与丙型肝炎病毒相似。利用定点突变方法,破坏IRES的颈环结构(SL)1、2以及IIIe区的关键性核苷酸,检测该突变对IRES功能的影响。研究结果显示,SL1、SL2和IIIe结构的破坏使得DHV-ⅠIRES的功能消失,表明SL1、SL2和IIIe区是维持IRES启动内部翻译起始功能的关键性结构域。

新城疫病毒classⅠ和classⅡ微型基因组的构建及其复制效率差异性的比较

为研究新城疫病毒(NDV)微型基因组的复制效率,本实验分别以NDV 9a5b(ClassⅠ)病毒株和La Sota(ClassⅡ)病毒株基因组骨架为平台,插入绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因替代病毒的整个编码区,只保留与病毒复制、转录和病毒包装相关的调控区域Leader和Trailer,构建获得的微型基因组DNA片段反向插入反向遗传载体TVT(0.0)中,从而构建了两株病毒的微型基因组质粒。同时,将相应病毒株的NP、P和L 3个基因分别克隆至pCI-neo载体中,构建3个辅助质粒的真核表达系统。通过将微型基因组和辅助质粒共转染BSR T7/5T7-5细胞,表明在相同转染条件下,无论使用哪一种辅助质粒,ClassⅡ型微型基因组的报告基因的表达效率均高于ClassⅠ型微型基因组。实验结果显示ClassⅠNDV转录复制系统的运行效率明显低于ClassⅡNDV。

鸡毒支原体穿梭质粒的构建

为构建大肠菌(E.coli)-鸡支原体(MG)穿梭质粒,本研究基于MG复制原点(oriC)部分活性序列区域,以pBluescript-SK(+)为骨架载体,庆大霉素为筛选基因,构建了E.coli-MG穿梭质粒pBSoriC-GmR,经PCR及western blot检测该载体能够在MG中稳定存在22代以上,并能够高效表达庆大霉素乙酰转移酶。本研究为利用该载体进行MG基因功能的研究奠定了基础。

Le和Tr序列对新城疫ClassⅠ毒株复制及转录水平的影响

为了研究新城疫病毒(NDV)前导序列(Leader,Le)和尾随序列(Trailer,Tr)对病毒转录及复制水平的影响,以9a5b病毒微型基因组为平台,通过对Le和Tr序列的二级结构预测,进行了一系列的缺失、突变、替换,成功构建了6株突变型微型基因组。通过共转染、实时荧光定量RT-PCR试验表明,当Le末端9～28nt替换为Tr末端9～28nt时,并不影响病毒基因的转录复制效率,当直接缺失Le的第2个干环结构或缺失Le 25位以后序列时,显著降低了病毒基因的转录复制效率;但当缺失Tr内部42nt或26位以后的全部序列时,病毒基因的转录复制发生了终止。证明Tr序列的保守性相对于Le序列而言,在NDV复制和转录过程中发挥了更为重要的作用。