口蹄疫病毒前导蛋白的分子生物学研究进展

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)编码的前导蛋白,不仅是一个重要的蛋白酶,而且对于病毒来说是一个重要的毒力因子,其能够作用于宿主细胞的特异性蛋白,抵抗宿主细胞所产生的抗病毒效应。本文章简述了口蹄疫病毒前导蛋白酶的基本特性,例如前导蛋白的基因结构与病毒复制的关系,前导蛋白酶活性的具体特点,以及前导蛋白影响病毒毒力的分子机制。

口蹄疫病毒反向遗传学研究进展

反向遗传学操作技术在口蹄疫病毒(FMDV)病原学基础研究领域的应用,使得人们能够在基因组整体水平上研究病毒基因的功能。得益于反向遗传学系统的不断完善和发展,目前人们对FMDV分子病原学也有了更加深入的认识和理解。本文结合实验室在FMDV反向遗传学方向上所开展的探索性研究工作,综述了国内外利用反向遗传学操作技术在研究FMDV分子致病机制、病毒毒力与变异的关系、病毒复制的影响因素、新型FMD基因疫苗的研制等领域所取得的进展,展望FMDV反向遗传学研究新动向。

猪RIG-I真核表达载体的构建及其抗口蹄疫病毒作用研究

为研究模式识别受体分子RIG-I是否具有抑制口蹄疫病毒(FMDV)复制的作用,本研究从猪的PK15细胞中提取RNA,通过分段扩增与融合PCR的方法,扩增猪的RIG-I的完整CDS序列,进一步构建猪RIG-I的真核表达质粒。通过Western blotting和间接免疫荧光试验对构建的真核表达质粒进行表达验证,证明其成功表达,同时证明猪RIG-I蛋白定位于细胞的细胞质中。感染试验发现FMDV能够诱导细胞内RIG-I的转录上调,这表明两者间存在着重要联系。过表达试验证实RIG-I具有抑制FMDV复制的作用,而下调表达RIG-I可以促进FMDV的复制,这表明RIG-I在机体抗口蹄疫病毒感染过程中发挥着重要作用。本研究的开展,为进一步探索RIG-I抗口蹄疫病毒的分子机制提供了理论支持;为口蹄疫病毒感染过程中,天然免疫系统抗病毒机制研究奠定了基础。

干扰素作用机制及其在抗口蹄疫病毒中的应用研究进展

干扰素(interferon,IFN)是人和动物细胞受到适宜刺激产生的一种微量的、具有高度生物学活性的糖蛋白,是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抗多发性硬化、抑制细胞增长和免疫调节作用的细胞因子。自20世纪50年代末发现干扰素以来,相关研究取得了巨大进展。文章综述了干扰素的抗病毒机制及其在抗口蹄疫病毒中的应用进展。

南非2型口蹄疫病毒结构蛋白抗原表位研究进展

口蹄疫病毒(FMDV)感染会引起偶蹄动物发生口蹄疫(FMD),产生急性系统性传染性水疱。其分为7个血清型,包括A、O、C型,亚州1型(Asia 1)及南非1、2、3型(SAT1、2、3)。其中,SAT FMDV具有明显的地域性,主要集中在撒哈拉沙漠以南,侵害水牛及野生动物,容易发生抗原变异,疫苗交叉保护效果低。近几年的报告表明,中东地区暴发了SAT2FMDV,跨越了长久以来的地域界限,也对我国的养殖业造成了潜在的威胁。我国在SAT FMDV方面的研究较少,有必要建立特异性和灵敏性高的SAT FMDV监测方法作为战略储备,以防其跨境传播。论文主要介绍了SAT2FMDV结构蛋白抗原表位国内外研究进展,以期为今后研发有关SAT2FMDV战略储备表位疫苗提供理论依据。

病毒样颗粒作为口蹄疫病毒抗原表位载体的研究进展

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)不含有病毒核酸,不具有自我复制的能力,但拥有与完整病毒粒子相似的空间结构和免疫原性,可以作为口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)抗原表位的载体,将其展示在它的表面。主要介绍了作为FMDV抗原表位的VLPs载体:FMDV-VLPs、HBc-VLPs、PCV2-VLPs和PPV-VLPs,并阐述了VLPs在几种表达系统中的组装现状,以期为今后有关FMD的VLPs研究提供参考。

NF-κB免疫生物学作用的研究进展

25年前首次发现NF-κB,其是免疫系统中诱导基因表达的重要调节因子,在免疫系统的发育和功能中发挥着重要的生物学作用。固有免疫和适应性免疫,免疫系统中各组织和细胞的发生和发育等过程都受转录因子NF-κB家族的调控。尽管有关NF-κB研究已经很成熟,但仍有许多新的重大发现。综述此领域的新的研究进展,从而为NF-κB在免疫生物学中的应用提供更广阔的视角。

我国O型Mya-98口蹄疫病毒流行情况与毒株分析

2010年年初，O型口蹄疫Mya-98毒株在我国引起疫情，随后在13个省区相继发生25次疫情。同时，该毒株也在日本、韩国、朝鲜等国家和地区报道流行，各国政府为控制疫情，大量扑杀染疫动物，引起了全球的广泛关注。为追寻我国O型Mya-98毒株的来源、归属地位和国内流行情况，收集我国2010年～2012年年底Mya-98口蹄疫流行毒株，对其进行毒株分离鉴定和VPl基因序列测定，并对其进行比对和分析。结果显示：我国O型口蹄疫Mya-98毒株源于东南亚国家，当前优势流行毒株与东南亚国家流行毒株等毒株同源性95％以上，属同-毒株；国内Mya-98毒株随流行历史不同趋向于形成3个不同的进化分支，不同分支之间毒株差异较大，最大差异率可达15％；我国Mya-98毒株宿主适应范围发生变化，由最初猪、牛、羊均可感染到2010年之后主要感染猪。

口蹄疫病毒通用型金标检测试纸条诊断方法的建立

为了兽医基层工作人员能够快速诊断口蹄疫病原,与其他传染病做鉴别诊断,有必要建立一种快速、简便区分它们的胶体金免疫层析方法。本试验采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。将纯化的Asia 1/China/05流行毒株12S偶联抗原的兔抗体制备免疫胶体金,喷免疫胶体金于玻璃纤维制成金标垫。将纯化A/AF72流行株12S偶联抗原的兔抗体和适量O/China/99流行毒株12S偶联抗原的兔抗体混合固定于硝酸纤维素膜上作为检测带。将羊抗兔抗体固定在硝酸纤维素膜的不同区域作为质控带,并组装成口蹄疫病毒通用型金标检测试纸条。利用其对阴性参考样品、各型阳性参考样品、已知背景的田间样品进行检测。灵敏度试验结果显示:建立的试纸条方法敏感性高、可检测到病毒最低含量为0.98×104 LD50;特异性试验显示:在检测与口蹄疫临床症状相似病原———猪水泡病病毒(SVDV)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)抗原时无交叉反应;重复性试验显示:不同批次间、同一批次内检测结果完全一致;符合性试验显示:检测国家口蹄疫参考实验室已确定口蹄疫病毒血清型的样品90份,阳性符合率、阴性符合率分别为96.70%、100%。本试验研发的口蹄疫病毒通用型金标检测试纸条具有很好的灵敏度、特异性、重复性和符合性,适合国内流行的口蹄疫病原的鉴别诊断。

南非2型口蹄疫病毒VP1基因的核苷酸及其氨基酸序列分析

VP1基因的遗传衍化关系是口蹄疫病毒分型的依据,而且许多重要的抗原位点也都位于VP1蛋白上。为了对南非2型口蹄疫病毒(SAT2-FMDV)VP1的编码基因序列及其氨基酸序列进行分析,为南非2型口蹄疫的诊断及疫苗设计提供理论基础,试验从NCBI下载大量的南非1/2/3型口蹄疫病毒(SAT1/2/3-FMDV)的1D2A2B基因片段,通过序列分析选择相似性较低的序列代表SAT1/2/3,将选中的代表序列连接于p UC57载体上进行合成,再对合成的含目的序列的穿刺菌进行划板、挑单克隆、摇菌、提质粒,得到重组质粒初步进行酶切鉴定后进行测序,测序正确后采用DNAStar软件包对这些合成序列进行分析。结果表明:SAT2-FMDV VP1的编码基因核苷酸序列变异度较大;虽然SAT2口蹄疫病毒VP1蛋白上主要抗原位点位置与其他血清型的差异性并不大,但是关键氨基酸已发生变化。

近年来全球口蹄疫流行统计及分析研究

近年来,随着民众对食品安全性意识的增强、肉蛋奶需求量的增多、养殖规模不断扩大,给牛羊养殖带来了挑战和机遇。目前,口蹄疫在世界各地的流行范围不断扩大、疫情活跃、经济损失惨重。该文从近年来发病分析得出,不同国家地区流行血清型不同、数量逐年增加、损失逐年增大,着重阐述我国A、O/mya-98型口蹄疫流行特点、规律、应对措施,为今后制定免疫程序、预防机制、建立健全法律法规有指导意义。

猪口蹄疫疫苗的研究现状及使用效果研究

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth diseasevirus，FMDV）引起猪牛羊等重要经济畜种发病的重大动物疫病，严重威胁畜牧业的健康可持续发展，涉及食品安全、物价稳定等一系列安全和社会问题[1-2]。FMD灭活疫苗为在全球范围内有效控制口蹄疫疫情做出了重大贡献，欧盟于1992年宣布停用FMD灭活疫苗，美国禁止在其本国领土生产FMD灭活疫苗。

口蹄疫病毒非结构蛋白2C基因主要表位区的表达及活性检测

根据测定的口蹄疫病毒(FMDV)2C基因序列,设计了一对特异性的表达引物,用于扩增2C基因5′-端174bp和3′-端279 bp连接片段,该区含有较丰富的B细胞表位编码序列。扩增片段通过NcoⅠ和SalⅠ酶切位点插入表达载体pET-30a。序列测定表明,目的基因片段连接正确,按正确的读码框插入表达载体中。重组表达质粒转化BL21(DE3)pLys,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western Blotting检测表明,2C基因主要表位区成功地在大肠杆菌表达,表达产物为约23 ku的融合蛋白,能够与FMDV感染动物血清发生特异性反应,而不与健康和灭活疫苗免疫动物血清反应。该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫转印(EITB)方法提供了所需的材料。

猪口蹄疫病毒受体β3亚基的基因克隆与分子特征

目的为研究β3亚基在口蹄疫感染过程中所扮演的角色,同时也为进一步深入研究FMDV嗜性、与宿主细胞的相互作用、病毒的侵入机制等问题奠定基础。方法从正常的猪肾细胞(pk15)中克隆到了整联蛋白β3亚基的基因,对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析并与真核表达载体pCDNA3.1(+)相连接。结果猪整联蛋白β3亚基基因的编码区含有2 355个核苷酸,编码785个氨基酸残基,其信号肽由22个氨基酸组成;胞外域由692个氨基酸组成,含有8个潜在的糖基化位点(NXS/NXT)和57个半胱氨酸(Cys)残基;跨膜区由29个氨基酸组成;胞浆域由41个氨基酸组成。猪β3基因与羊、人、马、犬、家鼠和挪威大鼠此基因核苷酸序列的同源性分别为94.3%、90.1%、92.1%、90.9%、86.1%、86.2%,推导氨基酸序列的同源性分别为95.0%、91.8%、92.5%、91.7%、88.8%、88.7%。结论通过生物学软件分析发现猪β3亚基形成复杂的2、3级结构,其中1-22位、715-743位氨基酸区段疏水性较强,分别是该亚基的信号肽和跨膜区,以及成功构建了β3亚基的重组真核表达载体pCDNA3.1(+)β3。

口蹄疫疫苗的质量控制研究

口蹄疫疫苗是一种灭活疫苗,是目前口蹄疫疫情爆发、流行、防控的最主要武器之一。因此疫苗的生产及质量控制关系着疫病的流行范围及感染率,把关疫苗生产、控制疫苗运输、储存,对做好口蹄疫防御工作起到至关重要的作用。

A型口蹄疫病毒A/HeN/1/2009株全基因组序列的测定及其基因特征分析

[目的]测定A型口蹄疫病毒A/HeN/1/2009株全基因组序列并分析其基因特征,为研究我国最近发生的A型口蹄疫病毒的致病性、流行规律以及筛选适用的疫情防控疫苗株奠定分子基础。[方法]应用RT-PCR方法,分段扩增、克隆A/HeN/1/2009株基因,并进行基因测序;借助DNAStar分子生物学软件,从分子流行病学角度分析A/HeN/1/2009株与参考毒株之间可能的遗传衍化关系。[结果]该毒株基因组全长8 171 nts[不包括poly(C)区段和poly(A)尾巴],其中5'-UTR和3'-UTR分别为1 080、92 nts,蛋白编码区为6 999 nts。分析A/HeN/1/2009株遗传衍化关系显示,该毒株划为东南亚拓扑型Laos03系的VN09亚系,同源性依次为87.3%～91.8%、93.7%～94.5%和96.9%～98.4%。[结论]VP1中A24V、N85R、S196T,3A中I61V、T128S、E147G和A134V在该毒群的进化过程中扮演重要角色;A/SH/1/2009株VP1 140-160基序为RSD。

Gα12蛋白抑制口蹄疫病毒在PK-15细胞上复制

鸟嘌呤核苷酸结合蛋白Gα12参与多种细胞反应的调节,但是在口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)方面的研究较少。本研究中,用FMDV感染PK-15细胞,发现Gα12的mRNA和蛋白水平都有所上调,预示Gα12可能与FMDV复制存在某种联系,需要进一步研究Gα12蛋白对FMDV在PK-15细胞上复制的影响。为此,在过表达Gα12和干扰Gα12表达的情况下,通过实时荧光定量、Western blot和TCID50检测Gα12对FMDV复制的影响。结果表明,过表达Gα12后,FMDV的mRNA水平、蛋白水平和病毒滴度都有所降低,然而,下调Gα12后,FMDV的复制呈相反的趋势,说明Gα12可以抑制FMDV在PK-15细胞上的复制。本研究首次发现Gα12具有抑制口蹄疫病毒复制的作用,为抗FMDV的研究提供了新思路和理论基础,对FMDV相关研究具有重要意义。

口蹄疫病毒A/GDMM/CHA/2013株结构蛋白VP1 H-2d限制性CTL表位预测

[目的]预测A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的H-2d限制性T细胞表位。[方法]使用多种在线表位预测软件,包括Syfpeithi、IEDB、Net MHC-3.2、IMTECH和BIMAS预测A型口蹄疫病毒VP1上可能有的H-2d限制性T细胞表位,然后用Prot Param软件分析预测出的候选表位。[结果]综合比较5个表位预测软件的预测结果,遴选出10个候选表位;再结合Prot Param软件分析结果,最后共预测出5个表位：其中H-2Kd限制性表位有第27-35、118-126位,H-2Ld限制性表位有第43-51位,H-2Dd限制性表位有第45-53、146-154位。[结论]预测出5条口蹄疫病毒结构蛋白VP1 H-2d限制性CTL表位,为进一步鉴定口蹄疫病毒CTL表位提供数据和基础。