猪囊虫和猪带绦虫病实验动物模型的研究进展

建立人-猪囊虫、猪带绦虫替代动物模型的实验技术在解决猪囊虫病研究的材料来源、以及在寄生虫入侵、致病性、免疫机制和宿主特异性等基础理论和临床应用研究中具有重要意义。因此,本文就猪囊虫和猪带绦虫病实验动物模型,尤其对啮齿类动物模型上取得的成就,以及新的研究动态和策略进行概述。目的是提高人们对猪囊虫和猪带绦虫病实验动物模型重要性的认识,促进和加快猪囊虫病研究的步伐,早日在我国有效控制人猪囊虫病。

转录间隔区(ITS)在寄生虫分子生物学分类中的应用及其进展

在寄生虫分子分类学研究中,利用核糖体DNA对寄生虫进行分类学,以及虫种进化关系学的研究,已经成为国际上普遍应用的方法。但由于它具有高度保守性的特点,所以很难在同种异株的区分上有所作为。内转录间隔区ITS是位于寄生虫的遗传物质特别是核糖体DNA(rDNA)上18S和28S基因之间的区域片段,由于它在生物种和亚种间变异较大,从而可以用来进行动物原虫种间以及株间的分类鉴定。因此,在分子分类学领域,越来越多的采用核rDNA的内转录间隔区(ITS)作为分子标记。本文介绍ITS作为分子标记在寄生虫分子分类中的作用及其进展。

兰州市宠物猫隐孢子虫流行情况调查及分子生物学鉴定

为探究兰州市宠物猫隐孢子虫的感染情况,采集兰州市五大主城区宠物猫粪便样品共计655份,提取DNA,采用套式PCR扩增结合测序的方法进行基因分型并构建遗传关系树。兰州市宠物猫隐孢子虫的感染率为3.97%(26/655),测序鉴定发现均为猫隐孢子虫(Cryptosporidium felis)。统计学分析结果显示,兰州市宠物猫隐孢子虫的感染率与品种、季节及样品来源显著相关(P<0.05)。结果表明,兰州市宠物猫携带隐孢子虫且存在传播给人的风险,研究结果为预防兰州地区人、猫感染隐孢子虫提供一定的依据。

小反刍兽疫病毒P基因的克隆及其结构与功能分析

【目的】对小反刍兽疫病毒P基因进行克隆,并对其结构和功能的关系进行分析,为研究小反刍兽疫病毒P蛋白的功能及其在病毒增殖过程中的作用奠定基础。【方法】利用RT-PCR的方法对小反刍兽疫P基因全长进行克隆,通过生物学软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对,利用I-TASSER进行三级结构预测,然后分析其结构和功能之间的关系。【结果】P基因和MV、CDV、RPV、DMV和PDV的P基因的相似性分别为62.9%、63.3%、64.4%、65.1%和60.4%,氨基酸的相似性分别为45.9%、46.2%、50.6%、50.3%和47.0%。三级结构表明该蛋白由3个结构域构成,中间是由多个α-螺旋构成的结构域,主要行使与L大蛋白和RNA结合的功能,两边分别是N-端和C-端结构域,C-端结构域含有3个α-螺旋,分别位于458—468aa、492—499aa和503—505aa位,主要作为N蛋白α-螺旋的结合位点。【结论】本研究成功地克隆小反刍兽疫病毒P基因,分析和预测了p蛋白的结构和功能的关系,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。

重组CE18蛋白在绵羊绦虫蚴病诊断上的应用

【目的】探讨细粒棘球蚴CE18重组蛋白作为绦虫蚴病免疫诊断抗原的应用价值,为筛选绦虫蚴病血清学诊断抗原提供依据。【方法】应用棘球蚴CE18重组抗原建立间接ELISA方法,分别对18份脑多头蚴、15份细颈囊尾蚴、19份棘球蚴感染绵羊血清及194份棘球蚴病疫区绵羊血清和13份健康羊血清进行检测,通过显著性差异分析评价CE18蛋白作为诊断抗原的意义。同时,应用生物学软件对CE18抗原蛋白同源序列进行分析,进一步从分子水平上提示CE18蛋白作为绦虫蚴病诊断抗原的依据。【结果】序列分析表明棘球蚴CE18蛋白基因为多种绦虫如泡状带绦虫、多头带绦虫、猪带绦虫等的共有序列,其蛋白质氨基酸序列相似性很高,不同种属之间高达99%,从分子水平上表明CE18蛋白为带绦虫蚴共同抗原成分之一。重组抗原CE18-ELISA方法检测绵羊血清抗体水平显示:脑多头蚴病、细颈囊尾蚴病、棘球蚴病和棘球蚴病疫区血清的阳性率分别为38.89%、73.33%、100%和76.14%,而对照组血清为阴性反应。【结论】CE18重组蛋白可作为绵羊棘球蚴病和细颈囊尾蚴病血清学诊断抗原,用于畜群活体检疫初筛试验。

宁夏西海固地区棘球绦虫感染的流行病学调查

为了解宁夏西吉、海原和原州区(简称西海固地区)的棘球绦虫的感染情况,用PCR方法检测犬粪中棘球绦虫DNA,用ELISA法检测B超筛查阴性的青少年儿童血清中抗棘球绦虫特异抗体(反映周围环境棘球绦虫卵的污染)。采用SPSS20.0统计分析资料,2检验比较不同组间阳性率的差异。结果显示,西海固地区,在检查的2 175份犬粪中,细粒棘球绦虫(E.g-DNA)阳性率分别为9.87%、6.10%、7.00%;多房棘球绦虫(E.m-DNA)阳性率分别为6.40%、1.52%、3.37%。在检查的5 706份人血清中,抗E.g抗体阳性率分别为45.46%、36.23%、42.18%,抗E.m抗体阳性率分别为8.38%、7.03%、20.48%。从终末宿主(狗)感染率和人血清抗体阳性率(非生活史中间宿主)可以证明两型棘球绦虫在该地区的传播流行非常活跃。

猪带绦虫仓鼠动物模型的建立

【目的】为开展猪带绦虫的病原学形态观察、生物学特性研究以及解决实验材料来源的问题,建立猪带绦虫的实验仓鼠动物模型。【方法】通过经口感染被免疫抑制的实验仓鼠,观察仓鼠体内绦虫的感染、生长发育及寄生部位等生物学特性,并利用压片技术和组织切片技术对检出的绦虫的形态结构进行研究。【结果】免疫抑制剂在5mg/只,感染一次就能使囊尾蚴发育到性成熟;在实验仓鼠体内,感染后40d的仓鼠体内就能检出具有体节的可见虫体,感染80d后的仓鼠体内能检出孕卵节片;检出的虫体多数吸附在小肠前1/3段,也有寄生在胆囊和胆管中的虫体,甚至偶见虫体钻出胆囊外堆积在肝脏附近;虫体头节上可见4个吸盘及两圈小钩;与人猪带绦虫相比,成熟节片较少。【结论】成功建立了猪带绦虫仓鼠动物模型,这使得成功解决猪带绦虫实验材料的来源问题成为可能,也为猪带绦虫的深入研究奠定了基础。

基因治疗及其在兽医学中的应用

基因治疗是20世纪90年代形成的,该技术的研究一开始就与动物医学的发展密不可分,主要是通过建立动物疾病模型分析和研究基因治疗各种层面上的问题,但它真正在兽医临床上的研究是近年才开始的。许多试验结果表明,一旦载体的安全性有了保障,基因治疗将有可能成为动物重大疫病有效预防和治疗的方法,在兽医学中有很广阔的应用前景。

基于靶向代谢组学研究环形泰勒虫对宿主细胞能量代谢的影响

环形泰勒虫感染宿主淋巴细胞可使其获得类似肿瘤细胞样的无限增殖能力,而细胞转化现象会伴随虫体的消失而终止,该寄生模式为人们更好地理解环形泰勒虫和细胞相互作用的分子机制提供了一个理想模型。本研究通过靶向代谢组学方法研究环形泰勒虫感染对宿主细胞能量代谢相关代谢物的变化情况,为进一步揭示其转化机制奠定基础。以环形泰勒虫转化细胞为试验材料,设置布帕伐醌(buparvaquone,BW720c)药物处理组、DMSO对照组及空白对照组,观察不同处理对环形泰勒虫感染细胞生长状态的影响;并在72 h时收集细胞样品,利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)的靶向代谢组学方法对不同处理组的细胞样品进行能量代谢相关代谢物检测,再运用能量数据库对检测到的代谢物变量进行化合物种类鉴别,使用最小判别二乘分析法(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)筛选差异代谢物。通过对转化细胞的药物试验发现,相对于对照组,试验组在24 h内细胞增殖无明显变化,从36 h开始试验组的细胞生长速度明显低于对照组,在72 h时两组间的活细胞数量相差最大。PLS-DA分析发现,代谢物变量可将药物处理组及DMSO对照组之间聚类区分,并筛选到21种组间差异的代谢物,药物处理组中有8个代谢物上调,13个代谢物下调。经富集分析发现这些代谢物主要是与能量代谢相关的代谢物,如谷氨酰胺、L-乳酸、苹果酸、丙酮酸、异柠檬酸等。同时用相应的试剂盒检测后发现,谷氨酰胺、L-乳酸及丙酮酸的含量在药物处理组和对照组的变化趋势与靶向代谢组学检测的结果一致。本试验通过靶向代谢组学分析环形泰勒虫感染细胞的差异代谢物和代谢途径,说明环形泰勒虫感染可显著影响感染细胞的能量代谢,为进步阐明环形泰勒虫转化细胞的机制提供思路。

重组酶聚合酶扩增技术及其在动物病原快速检测中的应用

建立动物疫病的快速诊断,对于我国养殖业疫病的预防及控制、进出口检疫、动物食品安全卫生等方面具有重大意义。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是近几年出现的1种有望替代PCR的新的核酸扩增技术。该技术主要依赖于3种酶:能结合单链寡核苷酸引物的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶。反应过程中不需要模板链的热变性,可以在恒定的低温条件下快速扩增DNA或者RNA。具有特异性强、灵敏度高、快速、操作简便、适用于现场快速诊断等特点,在动物疾病早期诊断、实地检测、进出口快速检疫等方面具有巨大的应用前景和市场。本文对RPA技术进行综述,以期为相关研究提供参考。

猪带绦虫不同阶段45W-4BX和18kD基因联合表达及保护性分析

【目的】获得不同发育阶段基因联合表达的具有良好免疫保护性的重组抗原,为研制高效的猪囊虫基因工程疫苗奠定基础。【方法】PCR扩增截去45W-4B基因的信号肽和C端17个疏水氨基酸序列,经BamH I和EcoR I酶切后与表达载体pGEX-4T-1连接转化BL21感受态细胞,酶切及PCR扩增鉴定阳性克隆。测序正确的质粒经EcoR I和Not I酶切处理后与截去信号肽的18 kD基因连接,构建双基因融合表达载体pGEX-4BX/18。用IPTG诱导的表达产物,进行SDS-PAGE电泳、Western blot分析活性。分别用300μg重组GST-4BX、GST-4BX/18蛋白免疫猪,间接ELISA测定抗体水平。感染后90 d剖检计算各组的减虫率,比较评价重组抗原的免疫保护性。【结果】4BX/18 kD在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物为50 kD的融合蛋白,并能被人囊虫和感染初期的猪囊虫阳性血清所识别。重组抗原免疫猪后45 d抗体达到峰值,联合表达重组抗原的减虫率为97%,GST-4BX免疫组的减虫率为95%。【结论】重组抗原4BX和4BX/18kD均具有较好的免疫保护效果,有望利用它们研制出抗猪囊尾蚴病的高效疫苗。

吕氏泰勒虫cDNA表达文库的构建及其抗原基因的免疫筛选

【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆,经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,其初级库容量约为1.0×106PFU,扩增文库的滴度为8.2×108PFU·ml-1,文库重组率为100%;通过免疫学筛选、测序和Blast软件分析,共获得30个新基因,其中15个基因已登录GenBank/NCBI。【结论】为研究泰勒虫疫苗、新型医药和诊断抗原,以及发展可持续性防制羊泰勒虫病提供基本材料。

亚洲璃眼蜱不同发育阶段及其组织中microRNA-10表达分析

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度为20—22个核苷酸(nt)且高度保守的非编码小RNA。迄今为止,在病毒、动物、植物中都有发现,如在Mareks病毒、果蝇、斑马鱼、人类以及拟南芥等多种生物中都有存在。其通过与靶基因特异性的碱基互补配对使靶基因降解或者受到抑制,在转录后水平调控靶基因的表达水平。miRNAs参与多种生物的细胞增殖、分化、代谢与死亡等多种生物学过程。为了解microRNA-10在亚洲璃眼蜱中的潜在生物学功能,试验获得亚洲璃眼蜱miR-10的前体、成熟体序列;分析亚洲璃眼蜱不同发育阶段及组织miR-10的表达水平,及亚洲璃眼蜱miR-10的生物学意义;为进一步研究miR-10与亚洲璃眼蜱生长发育间的关系奠定基础。【方法】用Trizol Reagent分别提取不同发育阶段及组织的总RNA,用SYBR?Prime Script TMmiRNA RT-PCR Kit(TaKaRa Code:RR716)制备cDNA。参考miRBase数据库中isc-miR-10(登录号:MI0012262)序列,设计特异性引物,通过PCR的方法从亚洲璃眼蜱中扩增获得miR-10前体序列,通过MEGA4软件将此前体序列与已知物种的miR-10前体序列进行比对分析;利用qPCR技术分析亚洲璃眼蜱不同发育阶段及组织miR-10的表达情况;推测miR-10在亚洲璃眼蜱中的生物学功能。【结果】获得亚洲璃眼蜱miR-10的前体序列CUACAUCUACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUUUGCCACUAGACUACAAAUUCGGUUCUAGAGAGGCUUUGUGUGG,大小为73bp;亚洲璃眼蜱的miR-10前体序列与肩突硬蜱的相似性最高,是95.9%,且与其他节肢动物相似性在88.9%—91.7%之间;miR-10在不同物种间高度保守。miR-10的成熟体序列为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU,种子序列为ACCCUGU。在亚洲璃眼蜱的不同发育阶段中,饥饿若蜱的miR-10的表达水平最高,是卵的48.3倍;饥饿成蜱是卵的7.78倍;饥饿幼蜱是卵的2.78倍。在饥饿雌性成蜱吸血过程中,吸血3d的成蜱是饥饿成蜱的约4.28倍,吸血5d的成蜱是饥饿成蜱的约0.31倍,饱血自然脱落的成蜱是饥饿成蜱的约0.087倍。吸血初期miR-10的表达量上调,随着吸血时间的延长其表达量逐渐下调;在唾液腺、气管、卵巢、表皮、中肠中miR-10的表达情况有明显不同,其中唾液腺的表达量最高,是表皮的13.2倍;卵巢的表达量是表皮的2.98倍,气管的表达量是表皮的6.46倍。【结论】从亚洲璃眼蜱中克隆miR-10序列,序列分析显示此序列在节肢动物中相对保守。miR-10在亚洲璃眼蜱不同发育阶段及不同组织的表达明显不同,表明其表达具有选择性;依据miR-10表达的差异性及已报道miR涉及的生物学功能,推测miR-10在亚洲璃眼蜱的细胞增殖、发育及吸血方面有潜在的重要作用。本研究为寄生虫miRNAs功能的研究提供一定的依据,并有可能为防控寄生虫疾病开辟新的途径。

亚洲璃眼蜱成蜱不同发育期miR-451与MIF表达谱的动态分析

[目的]micro RNA(miRNA)作为一类内源性的非编码RNA,仅有18—25 nt,其广泛存在于动植物细胞中,可诱导生物基因沉默,参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。以亚洲璃眼蜱为研究对象,对miR-451及其靶基因(巨噬细胞游走因子,MIF)在相互作用关系进行分析。[方法]参考miR-451成熟体序列(AAA CCG UUA CCA UUA CUG AGU UU)来自研究单元亚洲璃眼蜱高通量测序所获得的结果。根据该成熟体序列设计stem-loop及PCR引物,RT-PCR扩增获得蜱源性miR-451序列;并对不同物种来源的miR-451序列特征进行分析。基因合成方法获得抑制miR-451的ds RNA序列,用于亚洲璃眼蜱饥饿成蜱体内注射。参考美洲钝眼蜱MIF基因(登录号:AF289543.2),设计亚洲璃眼蜱的特异性实时荧光定量引物,以β-actin作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR方法检测注射ds RNA后亚洲璃眼蜱饥饿成蜱不同发育时间点MIF基因的表达水平,以及miR-451的表达谱特征。[结果]琼脂糖凝胶电泳检测miR-451的PCR产物条带与预期大小一致,为72 nt。不同物种来源的miR-451具有较高的保守性,特别是种子序列极度保守,仅在短尾负鼠miR-451成熟体的19位点处存在A→U的突变。miR-451的RNA干扰实验证实,0-30 h miR-451表达逐渐上调,6 h达到最高值,其拷贝数为1.0×108。随后表达丰度逐渐降低。30 h其表达水平与PBS对照组相同。48-60 h miR-451再次出现一个表达上调微小变化过程。而miR-451抑制后的MIF直到30 h才有表达的上调,42 h达到峰值(拷贝量仅为9.0×103),此后其表达规模受到抑制,48 h时与PBS对照组水平一致。84 h后表达才逐渐上调,直到90 h达到峰值,并呈现正态分布趋势。[结论]利用RT-PCR获得亚洲璃眼蜱成蜱阶段miR-451序列,生物信息学方法分析了miR-451序列在不同物种间具有较高保守性。miRNA的保守性决定其靶标基因的特异性,因此,以上结果提示miR-451在动物细胞中可能扮演重要的生物学功能,是MIF功能发挥的一个重要调控因子。MIF作为miR-451靶标基因,其功能的实现可能受该miRNA的调控。基于此类推测q PCR及RNA干扰分析表明,miR-451参与了MIF的表达调控。且是一种负调控作用。当miR-451表达量升高时,MIF表达量明显下调。此研究首次证实miR-451在亚洲璃眼蜱成蜱发育阶段的表达是一种普遍现象,且对MIF存在负调控作用。这一研究为后期miR-451参与蜱的免疫应答及miR-451与靶标基因的相互作用机制提供了参考。同时证明,miRNA参与基因功能的调控具有一定的特异性和时序性。

柔嫩艾美耳球虫多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的基因表达及转录动态分析

蛋白质翻译后O-糖基化修饰普遍存在于真核生物、细菌和古细菌,多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(polypeptide:N-acetylgalactosaminyltransferase 2,ppGalNAc-T2)是O-糖基化反应的限速酶。基因组数据分析揭示艾美耳球虫具有O-糖基化反应途径。为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)蛋白质翻译后糖基化修饰及其关键酶的药靶效用,对Et ppGalNAc-T2基因进行了克隆,并检测其在E.tenella不同发育阶段的表达动态。根据EuPathDB中所预测Et ppGalNAc-T2基因序列设计引物,以RT-PCR方法扩增获得Et ppGalNAc-T2的ORF,插入酶切位点后连接到原核表达载体pGEX-6p-1进行诱导表达。提取E.tenella广东株未孢子化卵囊、孢子化7h卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子5个发育阶段的总RNA,以qRT-PCR法检测Et ppGalNAc-T2转录水平的动态变化。结果表明,Et ppGalNAc-T2的全长ORF为1 983bp,编码660个氨基酸,在E.coli Transetta(DE3)可溶性表达。qRT-PCR结果显示,Et ppGalNAc-T2转录水平随发育阶段不同而有显著差异,子孢子阶段表达水平最高、而在孢子化卵囊则几近不能检出。结果为进一步研究EtppGalNAc-T2的功能提供了试验基础。

环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析

【目的】环形泰勒虫(Theileria annulata)可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞,并可使被感染细胞发生转化,体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库,筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞(即非转化宿主细胞)为试验材料,提取总RNA和m RNA,反转录合成c DNA;然后分别作为tester和driver,进行抑制性消减杂交(SSH),构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库;对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序,共获得了有效表达序列标签(ESTs)364条,大小主要分布在350—1 200 bp之间;将这些ESTs序列在Gen Bank中进行BLASTn网上序列比对,其匹配于192条基因序列;其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条(其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列)和1条未知序列;其中已有功能注释的ESTs 285条,再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程(biological process)、细胞组成(cellular component)和分子功能(molecular function)3个部分进行GO聚类分析,结果表明,宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外,通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析,结果表明,肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术,成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库,筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因,并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因,为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。

莫氏巴贝斯虫滑动体组件蛋白基因gap45、gap50、myo A和mlc的克隆表达与多克隆抗体制备

【目的】克隆和表达莫氏巴贝斯虫滑动体组件蛋白GAP45(gliding associated protein 45,GAP45)、GAP50(gliding associated protein 50,GAP50)、肌球蛋白A(Myosin A,Myo A)和肌球蛋白轻链(myosin lightchain,MLC)基因及制备兔源性多克隆抗体。【方法】利用末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术从莫氏巴贝斯虫裂殖子cDNA中扩增gap45、gap50、myo A及mlc基因,将获得的全长或基因的部分序列构建pGEX-4T-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)pLys中用IPTG诱导表达;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并用ELISA测定抗体的效价及反应性。【结果】获得了gap45、gap50、myo A和mlc基因的全长分别为664、1391、773和2 538 bp,开放阅读框长度分别为567、1194、606和2 514 bp,制备的多克隆抗体具有较好的特异性,效价高于1:25 600。【结论】克隆了滑动体组件蛋白gap45、gap50、myo A和mlc基因的全长,并制备了多克隆抗体,为筛选巴贝斯虫疫苗和诊断用抗原和药物靶位、研究其生物学入侵机制奠定了基础。

一种无外源菌DNA污染的鸡球虫卵囊的制备方法

为了获得无鸡肠道和粪便细菌DNA污染的鸡球虫卵囊,试验采用实验室制备的无微生物污染的水配制相关试剂,对柔嫩艾美耳球虫卵囊采用漂浮纯化、灭菌处理和外源菌DNA去除等方法,获得高纯度的柔嫩艾美耳球虫卵囊;提取卵囊的基因组DNA,用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增并进行序列分析,以鉴定该卵囊是否被外源菌DNA污染。结果表明:提取的柔嫩艾美耳球虫卵囊基因组DNA经PCR方法检测外源DNA呈阴性。说明用此方法制备的柔嫩艾美耳球虫卵囊无外源菌DNA污染,可用于制备高纯度的无外源菌DNA污染的鸡球虫卵囊。

我国羊巴贝斯虫trap基因结构及遗传进化分析

本研究拟解析我国羊巴贝斯虫trap基因的结构特征,并以其为分子标志开展遗传进化分析,为理清我国羊巴贝斯虫的分类关系提供数据。用公布的巴贝斯虫trap基因序列BLAST两个羊巴贝斯虫全基因组本地数据库,以获得的保守序列片段为模板,设计PCR引物;克隆我国分离的6株羊巴贝斯虫trap基因全长序列,分析其序列结构特征;比对序列相似性,构建系统发生树,分析其遗传进化关系。结果克隆获得6株羊巴贝斯虫trap基因,分析结果显示,其具有3、4、5个内含子的三种内含子数目,预测的开放阅读框(ORF)大小分别为1 944、2 100/2 142和2 286bp;氨基酸序列分析显示,其都具有TRAP蛋白家族特征性的vWFA、TSR、跨膜域和CTD结构域;进化关系分析显示,感染我国羊的巴贝斯虫被分成3组,组内序列相似性为99.8%~100%,而组间为43.6%~74.6%。系统发生树上6株羊巴贝斯虫被分到两大枝,羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫,而且莫氏巴贝斯虫又被分成两小枝。6株羊巴贝斯虫trap基因结构存在差异,但其蛋白特征性的结构域较为保守;我国分离的羊巴贝斯虫为两个种,但莫氏巴贝斯虫中可能存在两个亚种。

柔嫩艾美耳球虫在鸡巨噬细胞中的培养及子孢子感染巨噬细胞细胞因子的mRNA水平

以鸡巨噬细胞(HD11)为柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)的宿主细胞,将E.tenella子孢子体外接种HD11细胞,观察其入侵细胞、发育及诱导细胞抗感染免疫情况。用荧光探针和real-time PCR方法分别检测细胞内NO和ROS的含量和E.tenella感染相关的8种宿主细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、iNOS和IRF7)mRNA水平。结果显示,E.tenella子孢子成功入侵HD11细胞,但并没有发育迹象。与不刺激组相比,活子孢子刺激后HD11细胞内NO含量在4 hpi显著升高,8 hpi达到最高并且随时间变化不再降低,而ROS含量在2 hpi显著升高,6 hpi达到最高并且随时间变化逐渐降低。与不刺激组相比,活子孢子刺激HD11细胞IL-1β和iNOS mRNA表达水平在6 hpi显著增加(P<0.05),IL-6、IL-10、IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、iNOS和IRF7在10 hpi显著增加(P<0.05)。与不刺激组相比,热灭活子孢子刺激后HD11细胞IL-6和IFN-γmRNA表达水平在4 hpi显著增加(P<0.05),IL-1、TNF-α和iNOS在6 hpi显著增加(P<0.05),而IL-10、IL-12和IRF7在10 hpi显著增加(P<0.05)。表明巨噬细胞抗球虫的免疫反应中,细胞因子的显著上调可能与机体抑制球虫发育增殖或清除球虫感染有关。