T细胞表位预测及其在抗口蹄疫病毒疫苗研发中的应用研究进展

随着分子免疫学研究的不断发展,对T淋巴细胞免疫分子机制的阐释,大量T细胞表位信息以及功能基因组学资料的积累,使得基于数据驱动的预测T细胞表位的研究受到重视,可能成为疫苗研发的重要工具之一。本文阐述了T细胞表位预测的理论和方法及其在抗口蹄疫病毒疫苗研发中的应用,并讨论了未来的研究方向。

同源重组介导的重组病毒研究进展

病毒同源重组是以同源臂为基础的将目的基因整合到病毒基因组中的技术。将表达盒串联到转移载体,通过同源重组构建重组病毒从而实现病毒基因改造、外源基因表达以及重组活载体疫苗制备等。就重组病毒的优缺点、构建原理及应用进展进行了概述,对重组病毒构建的难点进行了分析,全面系统地阐述了重组病毒的构建模式,针对基因框(启动子-报告基因-目的基因-调控元件-终止子)给出具体的构建方案,同时对其未来发展前景进行了展望,以期为今后重组病毒的构建提供理论基础。

副猪嗜血杆菌生物被膜形成与功能的研究进展

副猪嗜血杆菌是存在于健康猪上呼吸道的一种致病菌,也是格拉泽氏病的病原。副猪嗜血杆菌生物膜的形成与其致病力的变化和造成慢性感染有直接关系,研究副猪嗜血杆菌生物膜的形成及功能对阐明致病菌的慢性感染和抗生素的耐受性具有重要的科学意义。本文就副猪嗜血杆菌生物被膜的形成机制、影响因素、功能、及其研究方法进行综述。

RNA干扰及其在口蹄疫病毒防御中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种真核生物细胞在转录后引发基因沉默的分子机制。目前,RNAi的分子机制及其功能仍然有待更加细致地阐明,但作为一种反向遗传学手段已经在基因功能研究中广泛运用,并已作为一种治疗策略运用于人类抵抗重大遗传性疾病和病毒性疾病的研究当中。本研究将对RNAi的分子机制及其在抗口蹄疫病毒功能方面的研究作出简要的概括和展望。

腺病毒在动物口蹄疫防治中的研究进展

由于腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合到动物宿主细胞染色体等优点,已被认为是最有效的转基因载体之一,成为重组疫苗和基因治疗研究的热点。本文就腺病毒载体的生物学特性、研究进展及在口蹄疫防治中发挥的重要作用进行综述。

山羊痘病毒A11R基因的克隆及生物信息学分析

为了分析绵羊痘病毒A11R蛋白质的分子特征,提取了山羊痘病毒古浪分离株(GL)的基因组DNA,设计引物进行PCR扩增,将PCR产物连接到p GEM-T Easy载体后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行序列测定,利用生物信息学软件对A11R基因序列进行预测分析。结果显示,A11R基因序列由954个核苷酸组成的开放阅读框,编码317个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量的理论值为36 091.7,理论等电点为5.14。A11R蛋白质的二级结构中,α螺旋占29.02%,β折叠占10.41%,其余60.57%为无规则卷曲。多序列比对分析显示,不同羊痘病毒分离株A11R序列高度保守,同源性在98%以上。进化树分析结果显示,GL株与NK株、TU株以及SA株在一个分支,说明它们之间具有较近的亲缘关系,上述研究结果为进一步研究A11R蛋白质的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白质分子间相互作用奠定了基础。

不同ELISA试剂盒检测感染猪口蹄疫病毒3ABC抗体效果比较

为更准确研究口蹄疫病毒(FMDV)感染猪非结构蛋白抗体变化规律,选取3种不同的试剂盒,分别检测接种O型口蹄疫病毒猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体。试验数据表明,人工感染O型口蹄疫病毒猪最早在感染后第5天检测到非结构蛋白抗体,至第7天3ABC抗体全部转为阳性;3种试剂盒检测最早3ABC抗体与症状对应关系有差异,每两种商业试剂盒呈现不同程度的相关性。其中A试剂盒显示出最大的灵敏度,而B试剂盒显示最高的特异性,C试剂盒的敏感性依可疑样品的处理方式而变化,因此对3种试剂盒进行比较,发现A试剂盒更稳定,更适合于猪FMDV非结构蛋白抗体检测。

细胞凋亡信号传导通路的研究进展

细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制,是有许多基因产物及细胞因子参与的一种有序的细胞自我消亡形式。细胞凋亡发生过程的启动和进行受到精确调控,具有独特而复杂的信号系统。各种凋亡信号通过信号传导通路传至细胞内,激活靶分子而产生细胞效应,引发细胞凋亡。一般认为,细胞凋亡存在3条主要通路:线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路,各通路间互相联系,共同调节细胞凋亡。

1-2月龄荷斯坦奶牛不同组织中FMDV受体亚基αv、β3、β6mRNA转录水平的相对定量研究

【目的】建立检测牛口蹄疫病毒(FMDV)受体亚基αv、β3、β6 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析受体αvβ3和αvβ6在不同器官组织中的转录水平。【方法】在对牛FMDV受体基因克隆和测序的基础上,设计实时定量PCR引物,以GAPDH为内参基因,采用△△Ct相对定量PCR方法检测分析FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA在1—2月龄荷斯坦奶牛体内不同器官组织中的转录表达谱。【结果】αvβ3在荷斯坦奶牛24种组织中均有不同程度的转录表达;αvβ6在甲状腺、硬腭、鼻内皮、喉头、肺、食管、肾、后蹄冠状带等组织表达量较高,在唇、舌皮、软腭、气管、心脏、瘤胃、直肠、前蹄冠状带等组织转录表达量适中,在唾液腺、下颌淋巴结、肝、脾、肌肉等组织未检测到表达;αvβ6在牛体内的表达分布与FMDV组织嗜性基本一致,αvβ6受体可能是决定FMDV组织嗜性的主要功能受体,αvβ3的组织分布似乎与FMDV组织嗜性无关,但不能排除αvβ3在病毒感染过程中的作用。【结论】建立了检测FMDV受体亚基mRNA在不同器官组织中表达水平的相对实时定量PCR方法。

防御素临床应用现状的研究进展

防御素是广泛存在于动植物及人体内的一类不含糖链的碱性阳离子多肽,具有广谱抗菌活性。在杀灭细菌、对抗癌症、杀伤病毒、转基因工程及食品方面有重要作用。本文从防御素的结构、生物学活性、临床应用等方面进行综述,从而为临床医学提供参考。

细胞免疫检测方法研究进展

细胞免疫在机体的免疫过程中发挥着重要的作用,掌握细胞免疫的各个过程对全面了解机体免疫反应、监测抗原变异、正确理解病原体致病的分子机制、自身免疫性疾病的治疗以及疫苗的研制等都具有重要的意义。笔者从体内功能检测、体外表型检测、体外功能检测3个方面系统地介绍了目前在细胞免疫检测研究中常用的检测方法,并对这些方法的优缺点进行了分析比较。

C型口蹄疫结构蛋白VP3的原核表达及生物活性

利用PCR扩增技术,以本实验室构建的C型口蹄疫pMD-P1重组质粒为模板扩增C型口蹄疫VP3片段,并连接到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建阳性质粒pGEX-VP3并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中。使用不同IPTG浓度进行诱导,收集菌液进行SDS-PAGE。使用Model 422 Electro-Eluter切胶回收目的蛋白,并进行Western-Blotting分析。结果得到50 ku左右目的条带,证实融合蛋白VP3大肠杆菌中得到以包涵体形式表达,且使用切胶回收后的蛋白能被C型口蹄疫阳性血清识别,具有良好的反应原性。

口蹄疫A型病毒AF/72株特异性鉴定及其豚鼠标准血清的制备

用口蹄疫A型病毒AF/72株的细胞毒AF/72/MF6/BF12,经测定其TCID50为108.0/ml;经RT-PCR获得其VP1基因序列,并与GenBank中的其他7株口蹄疫A型病毒株比对,同源性均大于85%;经间接夹心ELISA测定,OD值均大于0.2,且该毒仅能被口蹄疫A型标准血清中和,具有型特异性;经紫外分光光度法测定其146S含量,均值为189 ng/ml,远大于22 ng/ml的国际标准。将此细胞毒与弗氏佐剂联合制成灭活疫苗免疫豚鼠后分离血清,经无菌检验和外源病毒检验,纯净性达到兽用生物制品标准要求;经ELISA检测此血清的抗体滴度、原血清、强阳性血清和弱阳性血清的中和效价均远小于1∶45。参照标准的要求,确定强阳性血清为口蹄疫A型病毒株AF/72的参考血清。

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段原核表达条件的优化

为了提高猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段在大肠杆菌中的表达量,研究了载体、温度、转速、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对衣壳蛋白基因CP239片段融合蛋白表达量的影响。结果表明,用LB培养基于37℃培养3.5 h后,采用终浓度为0.3 mmol/L的IPTG在37℃、200r/min诱导培养4 h,pET32a-CP239融合蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测结果表明pET32a-CP239融合蛋白的分子质量与预期大小一致,约为45.3 ku;Western blotting结果表明,pET32a-CP239融合蛋白可以与抗-HEV阳性血清发生特异性反应,并具有良好的反应原性,说明衣壳蛋白基因CP239片段蛋白得到正确表达。

家畜布鲁氏菌BP26基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

利用原核表达的布鲁氏菌BP26蛋白作为标准抗原蛋白,建立布鲁氏菌病抗体检测方法。本试验从布鲁氏菌S2疫苗株通过PCR扩增获得BP26基因,构建融合表达质粒pET-28a-BP26后并转化BL21宿主菌,IPTG诱导表达,应用Western blot鉴定表达产物,并以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,建立布鲁氏菌病抗体ELISA检测方法。结果表明,通过反应条件优化确定抗原的适宜包被浓度为5μg/mL,血清适宜稀释度为1∶20,二抗的适宜工作浓度为1∶20 000;通过敏感性试验结果表明,当血清稀释至1∶1 280时,仍检测为阳性;通过批间、批内重复性试验,变异系数均小于10%,表明本检测方法具有较高的重复性。用该方法对100份临床样本进行检测,并与试管凝集试验(SAT)进行相符性验证,符合率为94%,为布鲁氏菌病临床血清抗体检测及流行病学调查提供了技术手段。

人、牛和羊叠朊基因的表达及牛叠朊蛋白抗血清的制备

叠朊(Dpl)是朊蛋白(PrP)的横向同源物,两者的功能密切相关。本研究旨在制备能够特异检测重组表达的或者动物组织中Dpl的抗血清,以用于研究Dpl的功能及其与PrP的关系。根据已克隆的汉族人、中国黄牛、甘肃土种羊的Dpl基因,将其Dpl成熟蛋白编码区分别定向克隆到表达载体pET-30a(+)上,将重组表达载体转入E.coliBL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。将表达并纯化的牛重组Dpl免疫4只青紫蓝兔,制备牛Dpl的抗血清,SDS-PAGE分析表明人、牛和羊的重组Dpl在E.coli中获得了高效表达。用Ni-NTA树脂亲和层析和胶洗脱法纯化了上述表达产物,ELISA和West-blot分析表明,制备的牛Dpl抗血清与重组人、牛和羊的Dpl以及牛和羊睾丸组织的Dpl发生了特异性反应,却不与重组人、牛和羊的PrP发生反应。上述结果表明制备的Dpl抗血清可以作为人、牛和羊Dpl的检测试剂和研究材料。

小反刍兽疫病毒H蛋白的表达及间接ELISA方法的建立

利用原核表达系统表达了小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)血凝素蛋白(H)作为ELISA包被抗原,建立了PPR抗体检测的间接ELISA方法,并对所建立方法的相关条件进行了优化。优化结果显示:抗原的最佳包被质量浓度为20mg/L;血清最佳稀释度为1∶80;酶标二抗的最佳浓度为1∶20 000;抗原抗体反应时间和酶标二抗孵育时间均为45min。批内及批间重复试验结果变异系数均小于10%,说明该方法具有较好的可重复性。检测羊口疮、羊痘、蓝舌病和山羊支原体血清结果均为阴性,说明该方法具有良好的特异性。检测临床血清样品80份,并与国外c-ELISA试剂盒比较,符合率为93.75%。因此,本方法可以用于小反刍兽疫的临床血清抗体检测及流行病学调查。

细胞型朊蛋白PrP^C与浮舰蛋白flotillin功能的研究进展

朊蛋白和脂筏是当今研究的热点。细胞型朊蛋白(PrPC)能够通过构象转变生成致病型的朊病毒(PrPSc),导致海绵状脑病的发生,但是目前关于PrPC的转变机制还不清楚。PrPC也是重要的信号转导蛋白,引发众多的信号转导事件。Flotillin属于新被命名为SPFH(stomatin/prohibitin/flotillin/HflK/C)的蛋白家族,是重要的脂筏标识性蛋白,它们不仅被动地担当着非胞膜窖脂筏的脚架,为蛋白质的相互作用和蛋白质复合体的组装以及信号转导提供平台,而且本身还主动地扮演着信号蛋白的角色,在许多的细胞事件中发挥重要作用。PrPC与flotillin能够发生相互作用,flotillin蛋白为PrPC的跨膜信号转导和PrPC转变成PrPSc提供了环境。本文重点综述了近5年来关于PrPC和flotillin蛋白功能的研究进展,尤其是信号转导方面的研究。

家畜布鲁氏菌外膜蛋白OMP31的原核表达及其应用

利用PCR技术从布鲁氏菌S2疫苗株中扩增获得外膜蛋白(OMP)31基因,构建了原核表达质粒p GEX-6P-1-OMP31,并转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达,应用Western blot方法鉴定表达产物,并以纯化的OMP31重组蛋白为诊断用抗原,通过反应条件优化,初步建立布鲁氏菌抗体ELISA检测方法。以羊布鲁氏菌病普查检测血清120份为样本,与试管凝集试验进行比较分析。结果:成功构建了p GEX-6P-1-OMP31原核表达载体,并在BL21中得以诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组蛋白分子质量约为52 ku,优化试验确定抗原的最佳包被浓度为3μg/m L,血清最佳稀释度为1∶20。试管凝集试验血清样本的阳性率为83%,采用OMP31作为包被抗原的阳性检出率为79%,二者的符合率为95%。研究表明,OMP31作为间接ELISA包被抗原用于羊布鲁氏菌病血清学检测具有良好的反应性和特异性。