非洲猪瘟病毒MGF 360-9L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

前期研究结果表明,非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答,故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列,进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法,分析该基因的一级结构并预测该基因的表达蛋白二、三级结构;根据GenBank公布的Georgia 2007/1(FR682468.1)序列,合成MGF 360-9L基因并构建其重组真核表达质粒,Western blot验证该基因表达后,将重组质粒转染至PK-15细胞,经染色后观察其蛋白的亚细胞定位。结果表明,以Ⅱ型Georgia 2007/1基因组中MGF 360-9L基因为参照,其在Ⅱ型ASFV毒株中高度保守,在54株不同基因型毒株间的相似性与ASFV系统进化关系一致,保守序列为3′末端378 bp片段,高级结构以α螺旋为主,核定位序列预测其定位于细胞核内;构建真核表达质粒,成功表达目的蛋白且定位于细胞核内。本研究结果为进一步研究MGF 360-9L基因抑制免疫应答和明确MGF 360基因家族在ASFV的致病机制积累了资料。

牛α-IFN及FMDV P12A3C双表达载体的构建及其在BHK-21细胞中的表达

从口蹄疫病毒Asia I/Jiangsu毒株的细胞毒中提取总RNA,通过RT-PCR方法分别获得FMDV的P12A及3C基因;同时以pMD18-T-α-IFN质粒为模板,PCR扩增得到α-IFN基因。将α-IFN基因及FMDV P12A及3C基因连接至双启动子表达载体pBudCE4.1上,构建成双效表达质粒pBudCE4.1-α-IFN-P12A3C,经电泳、PCR、双酶切和DNA测序鉴定表明双效质粒载体构建成功。用此重组质粒转染BHK-21细胞后并对其表达情况进行检测,表明该双表达质粒在BHK-21细胞中能够成功表达。以此重组质粒免疫乳鼠后12 h,按100 TCID50/0.1 mL的量进行攻毒,结果发现该质粒能够抑制病毒的增殖,对乳鼠有一定的保护作用。结果表明成功构建了牛α-IFN及FMDV P12A3C组合基因双表达载体,为进一步研究口蹄疫基因疫苗提供前期基础。