牛支原体能量耦合因子转运蛋白S组件Mb BioY摄取外源生物素的功能分析

牛支原体(M.bovis)感染与生存依赖于外界微环境提供的各类营养代谢因子。开展M.bovis外源生物素摄取的机制研究,将对M.bovis防控具有极其重要的意义。通过对M.bovis PG45 Mb BioY(MBOVPG45_0349)基因进行系统发育分析、分子对接分析,筛选M.bovis PG45 Mb BioY突变株,比较PG45和PG45ΔMb BioY的生物素敏感性,异源构建Mb BioY功能性克隆验证其功能。结果表明,PG45染色体上存在一种崭新的生物素膜转运蛋白,全长996 bp,GC含量30.95%,蛋白长度为332个氨基酸,是由7个跨膜结构域组成的能量偶合因子(ECF)转运蛋白S成分Mb BioY。进一步验证后发现,当M.bovis缺失Mb BioY会影响其生长,表现出生物素代谢营养缺陷的表型。通过异源敲入生物素代谢营养缺陷大肠杆菌MG1655,表明Mb BioY单独存在时,就能够恢复生物素代谢营养缺陷大肠杆菌缺失株的生理功能。初步证明,Mb BioY编码的是能量偶合因子(ECF)转运蛋白的S成分具有摄取外源生物素的能力,该研究结果将补充细菌生物素代谢调控的多样性和复杂性,为M.bovis的有效防控提供独特视角。

绵羊肺炎支原体GH3-3株全基因组测序及生物信息学分析

【目的】全面了解绵羊肺炎支原体GH3-3株的基因序列,研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制。【方法】采用体外培养,利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组DNA,进行全基因组测序。【结果】绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组大小为1060772 bp,GC含量为29.66%,基因组组分分析后发现,GH3-3株的基因组含有730个编码基因,总长度为914379 bp,平均长度为1252.57 bp,占基因组全长的86.2%。串联重复序列共149个,总长为20926 bp,占基因组全长的1.97%。微卫星DNA序列102个,tRNA 30个,rRNA 3个。在NR、SwissProt、GOG、KEGG、GO、CARD、CAZy、PHI、TCDB、RMS数据库中,分别有719、459、473、394、449、33、5、180、113、59个基因被注释;在VFDB数据库中,共注释到了76个毒力因子相关的基因。将基因组序列提交至NCBI网站,获得登录号为:PRJNA1051969。【结论】获得了绵羊肺炎支原体GH3-3株完整的基因组信息,预测和注释了其基因的功能,明确了GH3-3株以及与国内外其他绵羊肺炎支原体菌株之间的遗传进化关系。

基于碳水化合物的佐剂作用机制研究进展

佐剂是指添加到疫苗中以刺激和增强免疫应答强度或改变免疫应答类型的物质。目前疫苗佐剂种类较多,包括铝佐剂、油乳佐剂和脂质体佐剂等,但临床使用的佐剂很少同时具备高效和低毒两大特点,因此迫切需要一种有效且安全的佐剂。基于碳水化合物的佐剂具有良好的生物相容性和易代谢的优点,同时,基于碳水化合物的佐剂种类广泛,且每种都有不同免疫特性,如基于多糖的佐剂可以增强巨噬细胞的吞噬活性及抗原提呈能力等。并且基于碳水化合物的佐剂还可与Toll样受体、C型凝集素受体等多种受体结合发挥上述免疫活性,但其作用机制尚不完全清楚。故本文基于碳水化合物的佐剂作用机制相关研究进展进行总结梳理,以期为相关佐剂的进一步研究提供参考。

L929细胞无血清悬浮驯化及其在流产衣原体灭活疫苗中的应用研究

为通过悬浮细胞培养方法规模化生产流产衣原体抗原,采用逐步降血清悬浮驯化法使贴壁L929细胞逐步适应悬浮培养环境,最终获得了一株可无血清悬浮培养的L929细胞株。将流产衣原体接种于L929悬浮细胞上,研究不同的促感染试剂以提高收菌量,并选择出最佳的培养方法制备流产衣原体灭活疫苗。以25μL、50μL、100μL的剂量免疫Balb/c小鼠,攻毒后检测其免疫保护效果。结果显示,当该L929悬浮细胞初始接种密度为5×10^(5)/mL时,培养72 h后细胞浓度可达到约7×10^(6)/mL,细胞活力在95%以上;在细胞密度为6×10^(6)/mL,接菌量为5.5×10^(4) IFU/mL,加入脂质体2000的量为1.7μL/mL、放线菌酮浓度为0.4μg/mL时,菌量增殖倍数最大,48 h内约扩增了52倍。经流产衣原体悬浮培养细胞灭活疫苗免疫后,小鼠产生的抗体水平随免疫剂量的增加而提升;接种50μL、100μL疫苗组小鼠的脾淋巴细胞增殖水平、IFN-γ、IL-2的含量远高于接种25μL疫苗和注射PBS组的小鼠;对免疫后的小鼠进行攻毒,接种疫苗组小鼠的脾脏、十二指肠、子宫中的流产衣原体基因组含量远低于未接种疫苗组小鼠。注射PBS组及接种25μL疫苗组的小鼠子宫出现了不同程度的坏死及炎症,而其余两组小鼠的子宫无异常变化。结果表明,本试验成功驯化出1株L929悬浮培养细胞株,并且通过悬浮培养工艺制备的流产衣原体灭活疫苗免疫效果良好,接种50μL、100μL该灭活疫苗可以有效抑制流产衣原体的感染,该L929细胞全悬浮培养株的成功驯化为疫苗规模化生产提供了技术支持。

HIF-1α在病原体感染中的作用研究进展

缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)是细胞应对缺氧反应的中枢调节因子,稳定的HIF-1α具有多种功能,参与血管生成、代谢调节、细胞自噬及细胞凋亡等多种生物学过程。HIF-1α的稳定性受到多种信号的调节,包括氧气水平、病原体感染以及代谢中间体等。近年来,越来越多的研究表明,HIF-1α在感染性疾病中起着重要作用。因此,本文就HIF-1α稳定性的调节机制及其在病毒、细菌等病原体感染和相关疾病发生发展中的作用进行讨论和总结,旨在为进一步解析HIF-1α在防御多种病原体感染中的作用和其作为靶向治疗的潜在靶点等相关研究提供参考。

牛支原体0580基因C端截短体的原核表达及生物学功能初步分析

旨在初步分析牛支原体(Mycoplasma bovis)PG45菌株0580基因的生物学功能。前期测试发现牛支原体PG45菌株、08M菌株、07801菌株都有溶解鼠红细胞的现象,根据NCBI中对PG45菌株的基因注释,筛选到1个假定与溶血素相关的基因MBOVPG45_0580。该基因编码的蛋白经预测具有4个跨膜区,全长表达困难,故构建了不含跨膜区的C端截短体原核表达载体Pcold III-0580-C,进行诱导表达以及纯化,并在小鼠中制备0580-C端重组蛋白的多克隆抗体,对0580-C重组蛋白溶红细胞能力、多克隆抗体效价及特异性、是否影响菌株黏附细胞的能力进行了探究。PG45菌株中假定的与溶血素相关的蛋白0580在牛支原体中的相似性高达100%,去除4个跨膜区的重组蛋白0580-C能在大肠杆菌中表达,相对分子质量约为37 ku;鼠红细胞溶血试验发现0580-C重组蛋白没有溶血活性,但黏附及黏附阻断试验发现该蛋白有助于提高牛支原体黏附EBL细胞的效率,0580-C蛋白鼠源多抗能有效阻断牛支原体对EBL细胞的黏附。制备的0580-C蛋白鼠源多克隆抗体效价达211,且能识别到3株牛支原体菌株(PG45、08M、07801)天然表达的0580蛋白,表明制备的0580-C蛋白鼠源多克隆抗体特异性较好。牛支原体中假定的与溶血素相关蛋白0580可能是一种新的黏附相关分子,为解析牛支原体MBOVPG45_0580基因的生物学功能以及牛支原体致病机制提供了新的见解。

绵羊肺炎支原体小鼠感染模型的建立

旨在探索小鼠作为绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)实验室感染模型的可行性,筛选建立Mo感染小鼠模型的最佳方法。将60只BALB/c小鼠随机分为对照组、Mo感染组1、感染组2、感染组3和感染组4(n=12)。Mo感染组1小鼠分别滴鼻30μL和腹腔注射25μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液各1次,Mo感染组2和3小鼠分别滴鼻2和3次30μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液,Mo感染组4小鼠喉头喷雾50μL 10^(8 )CCU·mL^(-1) Mo NJ01株菌液2次,对照组用正常培养基处理。分别于感染后第0、7和14天称量小鼠体重。感染后第14天处死所有小鼠,采集血液和肺组织。通过HE染色法进行肺组织病理学检查、剖检进行肺组织病理评分、qPCR方法检测肺组织中Mo的载荷量和ELISA检测血清Mo IgG水平,确定小鼠感染模型是否建立成功及最佳建立方法。Mo感染组2和组4中小鼠体重第14天时分别比对照组显著降低17.2%(P<0.05)和21.6%(P<0.05);感染第13天,感染组2和组4小鼠出现死亡;感染后第14天剖检,Mo感染组2和组4小鼠肺部有炎症,肺病变平均评分分别为3.5和3.3,均显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),而对照组小鼠无病变;组织病理学检查发现,Mo感染组小鼠肺可见不同程度的间质性肺炎,肺泡腔内有炎细胞浸润;对照组小鼠肺组织结构正常、完整,肺泡内未见明显细胞浸润。小鼠肺组织中Mo DNA拷贝数在Mo感染组1和组3中分别为10^(2.56)和10^(3.21)拷贝·g^(-1);感染组2和组4分别为10^(3.84)和10^(3.77)拷贝·g^(-1),且显著高于Mo感染组1(P<0.05)和组3(P<0.05),对照组为阴性。小鼠血清Mo抗体OD_(450 nm)值在Mo感染组1、组2、组3和组4分别为0.63、1.05、0.81和0.99,均显著高于对照组(P<0.05),且组2和组4均显著高于1组(P<0.05)。本研究通过1×10^(8 )CCU·mL^(-1)的Mo NJ01株菌液滴鼻2次或喉头喷雾2次均可成功建立Mo感染小鼠模型。为绵羊肺炎支原体的致病机制及防治策略研究奠定基础。

Tollip敲除猪肾细胞系的构建

旨在探究Toll作用蛋白(toll-interacting protein, Tollip)对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)增殖的影响,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tollip基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney cell line, PK-15),并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,然后利用CCK-8试剂盒测定Tollip缺失后细胞活力变化,确认敲除细胞与野生细胞无显著差异,用FMDV感染敲除细胞后,采用Western blot、间接免疫荧光、实时荧光定量和病毒滴度测定等方法测定病毒在敲除细胞系中复制情况。结果显示:感染FMDV后,敲除细胞与野生细胞相比,显著促进了病毒的复制。综上,在PK-15细胞上,成功构建Tollip缺失细胞系,且试验表明Tollip的缺失有助于FMDV的复制。研究结果为后续Tollip功能研究及抗病毒机制研究提供理论依据。

猪源SIRT5促进O型口蹄疫病毒在PK-15细胞复制

目的探究猪源SIRT5对O型口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus serotype O,FMDV-O)复制的影响及其调控FMDV-O复制的初步机制。方法利用Western Blotting和RT-qPCR检测FMDV-O感染PK-15细胞后内源性SIRT5表达情况;设计合成3对SIRT5特异性siRNA,通过Western Blotting和RT-qPCR检测SIRT5、FMDV-O蛋白水平、转录水平及病毒拷贝数的变化情况;构建SIRT5真核表达质粒转染至PK-15细胞,运用Western Blotting、RT-qPCR实验方法探究过表达SIRT5对FMDV-O复制的影响,同时利用RT-qPCR检测过表达SIRT5对SeV、FMDV-O诱导的I型干扰素刺激基因mRNA表达水平的影响。结果FMDV-O感染PK-15细胞后内源性SIRT5的表达上调;siRNA干扰SIRT5抑制FMDV-O的复制;过表达SIRT5促进FMDV-O复制;过表达SIRT5降低了SeV、FMDV-O诱导的干扰素刺激基因mRNA的表达水平。结论FMDV-O感染刺激宿主SIRT5表达,而猪源SIRT5通过抑制I型干扰素刺激基因的产生进而促进FMDV-O复制。本研究为进一步探究猪源SIRT5促进FMDV-O复制的机制提供参考依据。

基于酶促重组酶扩增的非洲猪瘟病毒检测方法

建立基于酶促重组酶扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸快速检测方法。针对ASFV B646L基因保守序列,设计特异性的ERA探针和引物,经过反应条件的优化,建立等温条件下检测ASFV DNA的ERA方法。结果显示:建立的ERA检测ASFV方法特异性强与其它病原无交叉反应;CV均小于10%,具有良好的重复性;对阳性样品拷贝数的检测下限为85 copies·μL^(-1);与世界动物卫生组织(WOAH)非洲猪瘟qPCR诊断方法对比,Kappa值为0.961,具有高度一致性。本研究建立的基于ERA检测ASFV方法可以用于ASFV的现场快速检测。

信鸽产酸克雷伯菌GS-BY-GG的分离鉴定

目的 分离并鉴定鸽源产酸克雷伯菌,探究其生物学特性及致病性。方法 剖检甘肃某信鸽棚发病鸽,观察并采集病变组织,通过观察病菌形态、生化试验、16S rRNA PCR鉴定和序列分析实现对致病菌的分离鉴定,结合组织病理学观察、药敏试验和致病性试验对分离菌株进行耐药性和致病性研究。结果 病鸽肝、肺、心等多器官出血,肝脏发黄且质地脆,肺脏发生化脓;从病鸽中成功分离到一株革兰氏阴性、短杆状菌株,麦康凯琼脂培养基上为粉红色光滑、湿润、圆形菌落,靛基质试验阳性;16S rRNA扩增序列与MN330093.1同源性达100.00%,表明病鸽感染产酸克雷伯菌,并命名为GS-BY-GG;产酸克雷伯菌GS-BY-GG对青霉素、氨苄西林和呋喃唑酮等10种药物耐药,对氟苯尼考、美罗培南和庆大霉素等5种药物敏感;组织病理学观察可见病鸽多器官出血,肝脏细胞排列不规则、多处可见棕黄色色素沉积,气管黏膜上皮广泛细胞坏死和脱落、黏膜层可见大量炎性细胞浸润;接种SPF雏鸡显示分离菌具有很强的致病性。结论 本研究成功分离了鸽源产酸克雷伯菌GS-BY-GG,研究结果为产酸克雷伯的临床诊断和防治提供数据支撑。

非洲猪瘟病毒D1133 L蛋白单克隆抗体抑制其复制

旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)和荧光观察分析D1133L单克隆抗体对病毒复制的影响。结果显示:不同浓度的单克隆抗体在不同的感染时间对ASFV的病毒效价(P<0.01),蛋白表达水平,基因转录水平(P<0.01),ASFV-GFP绿色荧光蛋白的表达水平(P<0.05)均有显著抑制,且这种抑制作用具有剂量依赖性。综上所述,D1133L单克隆抗体可显著抑制ASFV的复制,试验结果在ASFV药物靶点的选择上具有一定的参考意义。

O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒单抗制备及双抗体夹心ELISA方法的初步建立

本研究旨在纯化O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒抗原,并制备单克隆抗体,为口蹄疫新型Cathay毒株的研究提供生物材料。PEG沉淀法纯化O型口蹄疫Cathay毒株抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞,用间接ELISA方法筛选阳性细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得2株能够稳定分泌特异性针对O型口蹄疫Cathay株病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为10E6与11C7。叠加试验表明,两株单抗的叠加率为49.45%,识别不同的抗原表位。间接ELISA和IFA试验显示,两株单抗与O型口蹄疫Cathay株病毒具有良好的反应性。单抗特异性检测结果表明,2株单抗均能特异性识别Cathay株口蹄疫病毒,不与其他口蹄疫病毒毒株交叉反应。抗体亚型鉴定结果显示,10E6单抗的轻链为Kappa链,11C7单抗的轻链为Lamda链,两株单抗重链类型均为IgG2a。结果表明,本研究成功制备了两株特异性结合O型口蹄疫Cathay拓扑型病毒的单克隆抗体,两株单抗均具有良好的反应性与特异性。应用两株单抗建立O型口蹄疫Cathay病毒的双抗体夹心ELISA检测方法,该ELISA检测方法特异性、重复性和敏感性良好,为O型口蹄疫Cathay毒株的快速诊断防控与研究建立了基础。

猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立

【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(VNT)结果呈正相关,与Western blotting方法的阳性符合率为95.8%;2018-2022年川东北地区的351份猪血清样品阳性率为7.12%。【结论】本研究成功截短表达了PCV3四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PCV3间接ELISA方法,为PCV3的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。

牛种布鲁氏菌ArsR2蛋白的原核表达及磷酸化位点鉴定

用原核表达系统表达并纯化牛种布鲁氏菌S2308株ArsR2蛋白,软件分析该蛋白相关信息,质谱鉴定该蛋白修饰位点。以牛种布鲁氏菌S2308株基因组为模板,通过PCR扩增arsR2基因,构建pET-32a-ArsR2重组质粒,经测序正确后,转化至大肠埃希氏菌感受态细胞BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析法进行ArsR2蛋白的纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;对牛种布鲁氏菌ArsR2蛋白的理化性质和磷酸化位点进行预测,通过质谱鉴定ArsR2蛋白的修饰位点。结果显示,成功表达并纯化ArsR2蛋白,ArsR2蛋白无跨膜区,存在磷酸化修饰,质谱鉴定出ArsR2蛋白具有2个磷酸化位点。表明原核表达的牛种布鲁氏菌S2308株ArsR2蛋白存在磷酸化修饰位点,为探究该蛋白的生物学功能奠定了基础。

围产期使用抗菌药物对PRRSV阳性猪场母猪和仔猪生产性能的影响

旨在评估围产期使用抗菌药物对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性猪场母猪和仔猪生产性能的影响。从广西某规模化PRRSV阳性猪场挑选280头临产母猪随机分为5组,在其围产期分别用替米考星、泰妙菌素、多西环素和泰万菌素等兽医常用抗生素,对照组不使用抗菌药物。采集各组断奶仔猪前腔静脉血进行PRRSV核酸和抗体检测,以评估各药物对防控仔猪PRRSV感染的效果;统计各组断奶仔猪腹泻窝数及比率,以探究常用抗生素对仔猪腹泻的防控效果;统计各组断奶母猪的断配间隔及断奶7、10 d内发情配种率,统计各组仔猪的窝均断奶数、断奶存活率和断奶重等生产指标,以评估围产期常用抗生素使用对母猪和仔猪生产性能的影响并计算使用药物所带来的经济效益。结果表明:泰万菌素、替米考星组断奶仔猪PRRSV核酸阳性检出率为0%,且PRRSV抗体水平显著高于对照组;泰万菌素组仔猪的腹泻率低于其它用药组及对照组;相关生产指标统计显示,与其他组相比,泰万菌素组仔猪断奶存活率及断奶均重最高,母猪的断配间隔最短,窝均损失资产更低。综上,本研究评估了围产期使用兽医临床常用抗生素对PRRSV阳性猪场母猪和仔猪生产性能的影响,发现使用泰万菌素可以有效阻断PRRSV垂直传播,提升仔猪抗体水平,显著改善断奶仔猪腹泻率;使用泰万菌素显著提升了仔猪断奶存活率及断奶均重,缩短了母猪的断配间隔,降低了窝均损失资产。本研究的开展为规模化PRRSV阳性猪场的有效药物使用提供了重要试验数据和理论支持,为在PRRSV大流行背景下实现规模化猪场降本增效提供了必要的补充措施。

稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^(ORF6)细胞系的构建及其对PRRSV增殖的影响

为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料,本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSVORF6基因的重组慢病毒质粒,将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒;之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞,利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选,连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系;并使用CCK-8试验评估过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光(IFA)评估MARC-145ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位,进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响;此外,还测定了PRRSV在MARC-145ORF6细胞系、MARC-145Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明,过表达PRRSVM蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响;RT-qPCR、Westernblot和IFA等试验结果表明,MARC-145ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外,稳定表达PRRSVM蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因;多步生长曲线表明,MARC-145ORF6细胞系促进PRRSV增殖,提高其病毒滴度。综上,本研究构建了可以稳定表达PRRSVM蛋白的MARC-145ORF6细胞系,发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。

一例猪轮状病毒的实验室诊断及VP7基因序列分析

为确定湖南省怀化市某规模化猪场仔猪腹泻原因,采用RT-PCR试验方法对病死仔猪肠道内容物及粪便进行流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒检测,并对RT-PCR产物进行测序分析、同源性比对。结果表明,仔猪腹泻为轮状病毒感染引起,经序列分析发现该毒株与G9亚型毒株位于同一分支上,且同源性最高,为95.8%,因此判断此次引起仔猪发病为G9型猪轮状病毒感染所致,为当前省内流行毒株。

非洲猪瘟病毒多基因家族MGF360-13L基因功能的初步研究

旨在初步探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)多基因家族MGF360-13L基因的功能。使用生物信息学软件对MGF360-13L基因进行分析;构建真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L并转染至293T细胞进行表达;利用同源重组方法构建基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,以相同的感染复数(MOI=0.01)在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中感染基因缺失毒株和亲本毒株(ASFV CN/GS/2018)后,利用红细胞吸附试验(HAD)计算病毒滴度并绘制体外生长曲线;以MOI=1将ASFV-ΔMGF360-13L和ASFV CN/GS/2018分别感染猪骨髓巨噬细胞(BMDM),利用qPCR和ELISA测定细胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。结果表明,MGF360-13L基因在ASFV基因Ⅱ型中相对保守,编码蛋白属于非分泌型、无跨膜区、亲水性好;构建的真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L被293T细胞表达;成功获得MGF360-13L单基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,与ASFV CN/GS/2018相比,其体外复制没有显著性差异;在ASFV-ΔMGF360-13L感染BMDM后,IL-1β、IL-6和TNF-α炎性细胞因子在转录和分泌水平都显著高于ASFV CN/GS/2018。本研究成功制备了ASFV的MGF360-13L基因缺失毒株,并证实了MGF360-13L基因作为ASFV复制非必需基因具有抑制炎性因子表达的功能,这为进一步注释ASFV MGF360-13L基因功能提供了线索。

牛支原体脂蛋白LppB的多克隆抗体制备及对天然蛋白识别分析

旨在克隆牛支原体脂蛋白LppB基因,并进行原核表达与纯化,制备其多克隆抗体,研究其对天然蛋白的识别能力。以牛支原体PG45、ZYJ5及GT01株基因组DNA作为模板,PCR扩增LppB基因,测序并比对分析;将合成的pET-30a-LppB质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达产物用Ni-NTA纯化,Western blot方法验证纯化重组蛋白,测定其反应原性;将纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其ELISA效价,Western blot测定多克隆抗体对牛支原体LppB的识别。结果显示:PCR扩增的LppB基因全长约1860 bp,与预期大小相符;LppB主要为可溶性表达,大小约为74 kDa,经Ni柱纯化后获得纯化蛋白,LppB蛋白具有良好的反应原性;制备出小鼠抗LppB多克隆抗体,ELISA效价为1∶25600,能够识别天然LppB蛋白。本研究成功制备出牛支原体重组LppB蛋白及其多克隆抗体,为LppB功能研究奠定基础。