细胞内转录拯救Asia1型口蹄疫病毒

【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDVAsia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经NotI线化后和表达T7RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48h后出现致细胞病变(CPE),第4代10h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒对乳鼠的致病力(LD50)差异不显著,具有相似的生物学特征。共转染试验重复多次,均拯救到FMDV病毒。【结论】成功建立了基于质粒为基础的FMDV的体内拯救方法。

O型与A型口蹄疫重组标记疫苗病毒株的制备及鉴定

为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/93病毒全长重组质粒p OFS/3A_(91-105)中,构建FMDV A型和O型嵌合的全长重组质粒p O/3A_(91-105)-AP1。该重组质粒经NotⅠ酶切线性化后转染于表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞中,拯救得到FMDV重组病毒。间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明拯救的FMDV为正确的A型和O型间嵌合及3A aa91-aa105缺失的重组病毒。病毒蚀斑和一步生长曲线表明拯救病毒的感染性和复制能力稍低于其亲本病毒。该型间嵌合标记病毒的成功拯救为研制防控边境地区A型FMD的储备疫苗奠定了基础。

反向遗传学技术在新型疫苗研制中的应用

随着分子生物学等学科的发展，出现了许多可以应用于疫苗研制的新方法和新技术，并在某些方面已经开始逐步取代传统的疫苗研制技术。其中，反向遗传学技术发展迅速，倍受国内外研究者关注。这项技术不仅为解析病毒蛋白在病毒复制周期和致病性中的作用提供了有效的研究工具，而且为研发RNA病毒为载体疫苗提供了新的思路和策略。

猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位

为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布。说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础。

利用SMART技术构建猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库

本研究旨在建立猪血管内皮细胞酵母双杂交cDNA文库,进而为研究猪瘟病毒的基因功能及致病机理提供良好的试验体系。体外培养猪血管内皮细胞,提取细胞总RNA,并用Oligotex mRNA Mini Kit纯化PolyA+mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。经CHROMA SPINTM TE-400Column纯化后的dsDNA与线性化的pGADT7-Rec共转化酵母感受态细胞Y187中,以同源重组的方式在酵母细胞内构建猪血管内皮细胞cDNA文库。结果获得的文库容量在6×106 CFU/mL,随机挑选24个克隆进行PCR检测,插入的片段大小集中在400~2 000bp之间,平均插入长度为1 000bp左右,文库重组率为100%。本研究为从文库中高通量地筛选出与猪瘟病毒互作的重组子,即寻找与该病毒相互作用的受体蛋白奠定了坚实的基础。