麻疹病毒核衣壳蛋白分子生物学及其应用的研究进展

麻疹病毒属（Morbillivirus）的病毒是一类重要的人和动物致病性病原。其中包括牛瘟病毒（Rinderpest virus，RPV）、小反刍兽疫病毒（Pestedes Petits Ruminants virus，PPRV）、犬瘟热病毒（Canine Distemper virus，CDV）和麻疹病毒（Measles virus，MV）^[1]。这些病毒在中性pH条件下，可以通过膜融合而感染宿主细胞。病毒粒子多为圆形或椭圆形，

6种鸡艾美耳球虫兰州株的致病性研究

在试验条件下,测定了鸡艾美耳球虫兰州株的毒力,为进行鸡球虫病疫苗免疫和药物防治效果评价试验等研究提供攻虫剂量的选择依据。试验设空白对照组(NC)、不同剂量感染组1组～8组,共9个组,每组20只鸡。结果显示:(1)NC组、第1组～第7组(第8组全部死亡)相对增重率依次为100%、77.23%、77.02%、76.42%、72.86%、63.91%、67.19%和42.06%,其中NC组相对增重率极显著高于所有感染组(p<0.01);第1组和第2组显著高于第5组和第6组(p<0.05),极显著高于第7组间(p<0.01);第7组极显著低于其他试验组(p<0.01)。(2)空白对照组、第1组～第7组各组料肉比依次为2.01、2.21、2.24、2.29、2.33、2.78、2.94和4.06,呈现出剂量依赖关系,其中第7组极显著高于其他各组(p<0.01);第6组和第5组显著大于NC组和第1组～第5组(p<0.05)。(3)攻虫后第8d,每组剖检5只鸡,各肠段平均病变记分各组依次为0、1.79、2.33、2.54、2.63、2.5、2.67和2.8。(4)感染后排卵囊高峰期间,各组平均每克粪便中卵囊数(OPG)值分别为0、3.05×104、2.35×104、32.20×104、62.23×104、60.45×104、103.51×104和150.11×104(第8组除外)。(5)各组死亡率依次为0、5.0%、5.0%、15%、25%、40.0%、45.0%、95%和100%。结果表明:本试验所选用虫株均具有较强的毒力,每只鸡感染6个虫种每个虫种1×104个孢子化卵囊时,感染鸡生长严重受阻;感染剂量为6个虫种每个虫种2×105/只时,半数感染鸡死亡;6个虫种每个虫种3×105/只的感染剂量可导致全部感染鸡死亡,因此,攻虫试验时选择6个虫种每个虫种1×104/只～1×105/只的剂量为宜。

猪白细胞介素-4重组蛋白的纯化及其生物学特性分析

用已构建好的重组表达载体pGEX-4T-IL-4转染E.coli,在最适条件下诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,表达出38 ku的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的25%,表达产物主要以包涵体的形式存在;对表达产物经变性、复性及初步纯化后再结合饱和硫酸铵沉淀和Sephadex-G100凝胶层析柱进一步纯化,所得蛋白的纯度约在90%以上。在体外利用MTT法检测其生物学特性,结果表明其具有较好的生物学活性,本试验为获得猪IL-4重组蛋白奠定了基础。

猪干扰素-γ哺乳动物细胞重组表达质粒作为疫苗佐剂在小鼠体内的组织分布及环境安全性研究

重组表达质粒作为免疫佐剂从实验室走向临床必须解决其对机体和生物环境释放的安全性问题。本研究以pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒作为免疫佐剂进行试验,探讨了其在小鼠体内组织的分布和生物安全性。将pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒经肌肉途径免疫小鼠,免疫后不同时间迫杀,并取各种组织抽提基因组DNA:一是利用PCR技术检测其在组织内的分布及与细胞基因组发生整合的可能性;二是以PCR技术检测免疫动物现场环境样品,监测pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒中的猪IFN-γ基因、CMV启动子基因和抗性基因是否转移和扩散到环境细菌中。结果表明,免疫24h后在小鼠的各组织中仅注射部位肌肉存在重组表达质粒,免疫5d后仅有1只小鼠注射部位肌肉和血液中存在重组表达质粒,免疫15d后所有动物的各组织中无重组表达质粒存在;同时未发现pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒整合到宿主细胞基因组和转化到环境其他细菌中。因此,认为pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒对动物和环境是安全的。

猪白介素4在CHO-K1细胞中的重组表达及生物学活性分析

将猪白介素4（Porcine interleukin4，PIL-4）基因亚克隆到真核表达载体pEGFP～N1中，构建重组表达质粒pEGFP—PIL-4，利用脂质体法转染CHO-K1细胞，采用荧光显微镜实时观察、RT—PCR和Western-blot分别检测CHO细胞转录表达目的分子的情况，通过MTT法检测所表达蛋白的生物学活性。结果在将重组质粒转染CHO-K1细胞中24、48h后的均观察到绿色荧光；经G418筛选14～20d后转染的细胞形成了阳性细胞集落，用RT-PCR扩增出约339bp的目的基因片段；经Western—blot检测到约为39000的特异蛋白分子条带，并证明在转染重组质粒的细胞中表达了高生物活性的重组蛋白。

四价鸡球虫苗的免疫效果研究

在实验条件下观察自主研制的四价鸡球虫苗(LCV)对平养鸡的安全性和免疫保护效果。试验设空白对照组(NC)、攻虫对照组(PC)和免疫组(VC)3个试验组,每组30只鸡。试验结果:空白对照组、攻虫对照组和免疫组的相对增重率依次为100%、84.77%和94.97%;免疫后(免疫后攻虫前)排卵囊高峰期间(免疫后5d～10d),免疫组平均OPG(即每克粪便中的卵囊数)为2.70×104,攻虫后排卵囊高峰期间(攻虫后6d～13d)攻虫对照组组平均OPG为2.32×106,高于免疫组(2.69×105)(p<0.01);攻虫后各组死亡率依次为0、10%和0;3个组的ACI(抗球虫指数)分别为200.0、154.77和184.97,免疫组试验效果最佳。结果表明,LCV安全性高、免疫保护效果理想,接种该疫苗后的鸡对较大剂量攻虫具有较强的抵抗力。

少孢节丛孢菌的分离鉴定及捕食线虫活性研究

为研究新疆地区捕食线虫性真菌的生物活性,本实验采用玉米粉琼脂培养基(CMA)培养分离自新疆不同地区的捕食线虫性真菌,通过对分离株纯培养物的形态学观察和18S rDNA基因序列分析,鉴定4株少孢节丛孢菌,分别命名为XA3、XA6、XD1和XD4。18S rDNA基因遗传进化分析表明,XA3、XA6、XD1和XD4新疆分离株之间同源性较高,与GenBank登录的少孢节丛孢菌CBS289.82株同源性最高,分别为99.6%、99.5%、99.1%和98.9%,与形态学鉴定结果一致。捕食线虫活性测定试验表明,4个分离株在CMA中的捕食率为92.8%～97.6%;体外对绵羊粪便中线虫幼虫的捕食率为90.7%～95.4%,均具有很强的捕食活性。本研究为研究绵羊消化道线虫生物防控制剂奠定基础。

鸡球虫苗(LCV-2号)安全性和免疫效果研究

在实验条件下,研究了鸡球虫苗LCV-2号对笼养鸡的安全性和免疫保护效果.试验设空白对照组、攻虫对照组、免疫1组（1个免疫剂量）、免疫2组（2个免疫剂量）和免疫3组（0.5个免疫剂量）,共5个试验组,每组10只鸡.试验结果表明：①空白对照组、攻虫对照组和三个免疫组的相对增重率依次为100%、84.0%、96.9%、91.0%和91.0% ②攻虫后第8 d,每组剖检2只鸡,肠道病变记分5个组依次为0、4、1、3和4分.③免疫期间,免疫1、2和3组的每克粪便卵囊数（OPG）平均值依次为4.2×103个、9.2×103个和5.4×103个 攻虫期间,攻虫对照组5.117×105个、免疫1、2和3组依次为0.797×105个、0.522 × 105个和1.171×105个.④攻虫后各组死亡率依次为0、75%、25%、25%和50%.⑤抗球虫指数（ACI）,5个组依次为200.0、88.0、166.9、148.5和120.0.总的来看,免疫鸡群对大剂量卵囊攻击有较强的抵抗力,其中免疫1组结果良好,免疫2组和3组结果尚不理想,因此,LCV-2免疫1组的剂量（1头份卵囊/只）为优选剂量.

鸡球虫病免疫防治策略研究进展

鸡球虫病是一种呈世界性分布的原虫病，给养禽业造成严重的经济损失，据统计包括防治该病所花的药费在内全世界每年损失约80亿美元，仅美国一年损失就高达45亿美元。目前，该病已被美国农业部列为对禽类危害最严重的五大疾病之一。该病多危害15日龄～50日龄的雏鸡，发病率高达50％～70％，死亡率为20％～30％，

绵羊痘病毒甘肃流行株糖蛋白基因ORF117的克隆及其原核表达

以甘肃景泰疑似羊痘(SP)患病绵羊的皮肤组织中提取的总DNA为模板,经PCR扩增获得SP病毒(SPV)ORF117基因。测序后分析表明,该基因由591个核苷酸组成,编码196个氨基酸;将该基因克隆于pET32载体中,构建重组表达质粒pET-ORF117,用IPTG在不同条件下诱导表达,确定其最佳表达条件。SDS-PAGE电泳分析表明,表达的融合蛋白分子质量为42 ku,主要以包涵体的形式存在。在IPTG浓度为0.1 mM、温度为37℃、诱导6 h时表达量最大,约占菌体蛋白的30%。Western blot试验表明,融合蛋白可被羊痘阳性血清识别,这为研究其在新型疫苗和诊断的研究奠定了基础。

长角血蜱甘肃株肌钙蛋白基因P27/30的克隆和序列分析

参照GenBank中长角血蜱致病性Okayama株肌钙蛋白P27/30基因的核苷酸序列,设计合成一对引物,从本实验室保藏的干净长角血蜱卵中快速提取总RNA,通过RT-PCR扩增出607 bp的肌钙蛋白基因,将其克隆于PGEM-T-Easy载体,对其进行序列分析,并推导出氨基酸序列,将这一序列与国内外已发表的长角血蜱肌钙蛋白基因进行比较分析。结果表明本实验室保藏的长角血蜱甘肃株与上述已发表的Okayama株核苷酸序列同源性为92.1%,氨基酸同源性为86%。长角血蜱甘肃株与Okayama株、四川孤雌生殖株的发育有一定差异。经RT-PCR分析表明,该基因在长角血蜱的卵、幼蜱、若蜱和饥饿成蜱这几个阶段均有表达。

多房棘球蚴感染对小鼠肝脂质代谢的影响

旨在探讨多房棘球蚴感染早期对小鼠肝脂质代谢的影响。选取60只清洁级BALB/c小鼠(6周龄,雄性)随机分为试验组和对照组,每组30只。试验组小鼠每只腹腔接种600个原头蚴,对照组小鼠腹腔注射等体积的PBS缓冲液。采用原位两步循环灌流及多步低速差速离心分离纯化肝实质细胞。利用高通量测序分析感染3月小鼠肝实质细胞差异表达的mRNA,并对其进行KEGG、GO分析和qRT-PCR验证。制备多房棘球蚴感染2、3和6月小鼠的肝组织切片,分别进行油红O染色,并通过qRT-PCR检测多房棘球蚴感染不同感染时期肝实质细胞脂质代谢相关基因的表达水平。结果表明,与未感染对照组相比,小鼠感染多房棘球蚴后3、6月肝脂肪沉积明显增多;感染2月的肝实质细胞脂质合成相关基因Scd1、Fasn和Srebf1,以及脂质氧化分解相关基因Acox1和Cpt1α均明显上调;感染3月的肝实质细胞Scd1、Fasn、Srebf1及Cd36的表达水平均明显升高,而Acox1、Cpt1α、Pparγ和Pparα的表达水平明显降低。上述结果表明,多房棘球蚴感染早期可能通过促进肝实质细胞的脂质合成,抑制脂质氧化分解,从而导致肝脂质沉积。

长角血蜱卵cDNA表达文库的构建

【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo(dT)引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109PFU·ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素(DQ248886)的核苷酸序列的同源性为97.8%。【结论】成功构建了长角血蜱卵cDNA表达文库。

猪Toll样受体2基因的克隆和序列分析

本研究从猪肠系膜淋巴细胞中,克隆了猪Toll样受体2基因(pTLR2)。基因序列分析表明,克隆的pTLR2基因ORF为2358bp,编码785个氨基酸,含15.01%的亮氨酸,含有一段21个氨基酸的信号肽序列;与GenBank中登录的pTLR2序列(NM_213761)的同源性为99.2%;与牛、马、绵羊和人的同源性较高,与家鼠、中国仓鼠相比次之,而与鱼类的最低。蛋白分子结构预测表明,该分子由胞外区(588个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(174个氨基酸)组成,其胞外结构域由多个串联重复的LRR基序(XLXXLXLXX)组成,而胞内区含有与人白细胞介素1受体(IL-1R)高度同源的区域即TOLL/IL-1受体同源区(TIR),说明pTLR2分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用,这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。

鸡球虫苗(LCV-2号)对笼养及平养鸡的免疫效果

在试验条件下,研究了鸡球虫苗(LCV-2号)对笼养和平养鸡的免疫效果。笼养鸡免疫试验比较了笼养鸡空白对照组、攻虫对照组、免疫不攻虫组、免疫攻虫组试验期间的相对增重率、存活率、平均每克粪便卵囊(OPG)值、攻虫后第8天的肠道病变和综合抗球虫指数。结果表明,免疫不攻虫组、免疫攻虫组攻虫后没有鸡只死亡;免疫不攻虫组相对增重率最高,为97.74%,显著(P<0.05)高于免疫攻虫组和攻虫对照组(89.72%和69.85%);攻虫对照组攻虫期间平均OPG值最高,为1.26×105,而免疫攻虫组仅为5.813×104;攻虫后第8天肠道平均病变计分,空白对照组0分,攻虫对照组、免疫不攻虫组及免疫攻虫组分别为4、1、2分;4组抗球虫指数(ACI)依次为200、62.18、192.74和178.76。平养鸡免疫试验,比较了平养鸡空白对照组、不免疫不攻虫组和免疫攻虫组(2组在同1个圈)的平均OPG值、相对增重率、攻虫后第8天的肠道病变。结果表明,和免疫攻虫组鸡群一起饲养的不免疫不攻虫组鸡群增重较快,相对增重率为99.39%,而免疫攻虫组鸡群为91.67%,但差异不显著;攻虫后第8天剖检肠道平均病变计分,空白对照组0分,不免疫不攻虫组和免疫攻虫组分别为1、3分;攻虫期间免疫攻虫组鸡群平均OPG为6.025×105、不免疫不攻虫组也达3.675×105,免疫期间分别为7.5×104、3.5×104;3组ACI依次为200、193.39和175.76。从总体看,LCV-2安全性高,对笼养鸡和平养鸡都有较强的免疫效果,且对平养鸡的效果优于笼养鸡。

启动子p7.5/p11在山羊痘病毒和羊口疮病毒中的启动功能验证

为验证痘苗病毒启动子p7.5/p11在山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORFV)中的启动功能,本研究通过p TKpp质粒以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建含有p7.5/p11-GFP表达盒的重组质粒p TKp-gpt-i-GFP-p和p TKpp-H-i-GFP,将其利用脂质体转染预感染GPV或ORFV的羔羊睾丸(LT)细胞中。结果显示,两种重组质粒转染LT细胞24 h后均可以检测到绿色荧光,表明p7.5/p11均能够有效的启动目的蛋白的瞬时表达。同时,构建用于GPV重组的通用转移载体p TKfpgigp,将含有小反刍兽疫病毒(PPRV)的F基因的重组质粒p TKfpgigp-F与GPV共转染LT细胞,经同源重组制备表达PPRV F基因的重组GPV(r GPV)。结果显示,r GPV在感染的LT细胞中F基因能够稳定表达。结果证明,痘苗病毒启动子p7.5和p11均能够被GPV或ORFV编码的RNA聚合酶所识别,从而启动外源目的基因的表达。因此,p7.5和p11可以用于表达外源基因的GPV或ORFV重组病毒的构建。

李氏杆菌溶血素基因的表达及活性分析

根据LMO溶血素基因hlyA设计引物,PCR扩增hlyA,将扩增产物与pMD18-T连接,重组质粒经酶切鉴定、PCR分析以及确证性测序。将由重组质粒pMD18-hlyA上扩增的缺失信号肽序列的目的片段与表达载体DGEX-4T-1分别酶切连接后,转化BL21细胞。筛选阳性克隆,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析,纯化重组融合蛋白进行溶血试验、小鼠致病力试验和间接ELISA分析。结果表明hlyA基因在大肠杆菌中成功表达分子量82Ku的融合蛋白,能裂解红细胞,且能被LMO阳性血清所识别。一定剂量腹腔注射能将小鼠致死。以此为包被抗原的间接ELISA可以将LMO阴、阳性血清分开。这表明GST-LLO融合蛋白具有良好的生物活性,可用于李氏杆菌病的间接ELISA诊断。

牦牛外周血单个核细胞抑制消减cDNA文库的构建及部分差异表达分子的克隆分析

为筛选牦牛外周血单核细胞(PBMC)差异性基因,以刀豆素A(ConA)和脂多糖(LPS)联合刺激的PBMC cDNA为实验组,未经诱导刺激的PBMC cDNA为驱动组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了丝裂原诱导刺激PBMC的消减文库并对其部分阳性克隆进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取16个阳性克隆,进行PCR鉴定,显示克隆的重组率大于93%,插入片段大小大部分集中在200bp～1000bp之间。随机挑取100个克隆进行测序及同源性分析,初步获得27条差异表达基因片段,其中24个为已知基因,3个为新ESTs序列;随机选择非重复的6个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率。结果显示,均从构建的消减文库中扩增到目的片段,其中5个为诱导性差异表达分子,1个为诱导特异性表达分子,说明该文库有较高的质量。本研究应用抑制消减杂交技术构建了牦牛PBMC的差异表达cDNA文库,并高通量克隆鉴定了相关功能基因片段,表明该技术手段有助于快速发现牦牛新功能基因。

用溶血素从感染红细胞分离羊泰勒虫裂殖子

用嗜水气单胞菌产生的细胞毒素—溶血素Ah-1,裂解羊泰勒虫感染的红细胞,通过Percoll密度梯度离心分离羊泰勒虫裂殖子,建立了一种自感染红细胞中分离泰勒虫裂殖子的快速方法。光学显微镜观察显示,所分离的羊泰勒虫裂殖子基本保留原有的正常形态,并从宿主细胞成分中游离。

兔豆状囊尾蚴Tp14基因的克隆及其序列分析

为鉴定兔豆状囊尾蚴(C.pisiformis)合适的诊断或免疫用抗原,本研究根据带科其他种属绦虫14ku基因的保守区设计引物,利用RT-PCR从C.pisiformis总RNA中成功扩增出长度为261bp的基因片段,命名为Tp14,预测其编码87个氨基酸。对其核苷酸同源性分析表明,该基因序列与泡状带绦虫、细粒棘球蚴、猪带绦虫基因序列的相似性均大于85%,处于同一进化分支上,表明该基因具有种属特异性;同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构、疏水性及抗原表位等方面的预测,认为其有望成为诊断或免疫用抗原。