口蹄疫病毒整联蛋白受体的研究进展

从组织分布、各毒株利用率、配体结合区介导感染的能力及β亚基胞质区作用等方面论述了4种整联蛋白ανβ1、ανβ3、ανβ6和ανβ8的研究进展,旨在阐明各整联蛋白决定口蹄疫病毒宿主组织嗜性的作用,并为口蹄疫病毒致病机制的研究提供理论依据。

O型口蹄疫病毒免疫层析试纸条检测方法的建立

为建立一种快速、准确检测O型口蹄疫病毒(FMDV)抗原的胶体金免疫层析方法,将兔、豚鼠抗O型FM-DV多抗用DEAE-Sephose层析柱纯化。胶体金标记O型豚鼠口蹄疫抗体,形成金标探针并将其喷涂于玻璃纤维上。兔抗O型FMDV抗体和羊抗豚鼠IgG分别标记于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带,各部件按顺序装配形成快速诊断试纸条。如果待检样品中含有O型FMDV,它将与玻璃纤维上的胶体金探针和兔抗O型FMDV抗体形成夹心复合物,并在检测带被固定,沉集反应形成肉眼可见的红色条带。在田间试验中,53份试验样本分别用试纸条和反向间接血凝试验进行检测,2种方法的阳性率分别为95.45%和90.91%。评价试验证实,本研究建立的胶体金免疫层析方法简便、快速,具有良好的特异性和敏感性,非常适于基层兽医实验室诊断时使用。

病毒固有免疫识别受体研究进展

固有免疫应答是机体抵御病毒入侵的第一道防线,其前提则是病毒固有免疫识别受体对病毒感染相关模式分子的识别。目前病毒固有免疫识别受体主要是Toll样受体家族和RIG样受体家族的成员。现就这些受体的特征及其在识别病毒感染相关模式分子过程中的作用作一综述。

副猪嗜血杆菌对部分常用实验动物的致病性试验

为筛选对副猪嗜血杆菌易感的实验动物，对部分常用的不同品种、不同品系实验动物进行了副猪嗜血杆菌致病性试验。用副猪嗜血杆菌血清型5型标准株（Strain Nagasaki）培养物，以2×10^8-2×10^10CFU的接种量，通过腹腔感染SPF级小鼠、大鼠、金黄地鼠、豚鼠以及清洁级豚鼠和兔。结果当接种量达到2×10^9CFU时，SPF豚鼠、清洁级豚鼠和SPF昆明小鼠出现死亡，在死亡豚鼠观察到典型的副猪嗜血杆菌病病理变化，而在死亡小鼠未见。其它各实验动物在上述剂量范围内均未发病或死亡，感染7d后剖检也未见任何异常。对死亡豚鼠和小鼠的各个组织器官进行副猪嗜血杆菌分离，结果在豚鼠的大脑、心血、肺、肝和腹水中分离到了副猪嗜血杆菌。提示豚鼠对副猪嗜血杆菌易感，可以做为建立副猪嗜血杆菌感染动物模型的候选实验动物。

口蹄疫病毒非结构蛋白2C主要表位区的原核表达及其单克隆抗体的制备

本研究制备并鉴定了口蹄疫病毒非结构蛋白2C的单克隆抗体(mAb)。以纯化的原核表达2C蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,所获得的杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选,有限稀释法克隆,直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体,用Dot-ELISA以及IFA对mAbs的特异性等进行鉴定。共获得4株抗重组蛋白2C的mAbs,其亚类鉴定结果3株为IgG1,1株为IgG2b,叠加ELISA初步判定4株单抗所识别表位相同或相近。Dot-ELISA显示这些mAbs与重组2C蛋白和(2C'3AB)蛋白以及口蹄疫病毒O/China99感染的BHK-21细胞中的2C抗原均可特异性结合,IFA结果显示所得单抗能与FMDV感染细胞中的2C蛋白特异性结合。本研究获得的针对2C蛋白的特异性mAb,为进一步研究2C蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定了基础。

口蹄疫病毒2C′3AB基因重组杆状病毒的构建及其表达

将含有口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白2C部分基因编码区及3AB完整基因编码区的基因片段2C′3AB重组于杆状病毒穿梭质粒pMelBac-B,经PCR、酶切及序列分析鉴定正确后,命名为pMel-2C′3AB。将重组穿梭质粒pMel-2C′3AB与杆状病毒骨架共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选及PCR鉴定,构建了含有目的基因的重组杆状病毒。用该病毒感染High Five细胞,细胞裂解液的SDS-PAGE电泳结果显示,出现一约为43ku的蛋白带,与预期大小一致;Western-blotting结果表明,该表达产物能被FMDV阳性血清及2C′3AB单克隆抗体识别;间接ELISA结果显示,表达的目的蛋白能与牛、羊、猪的O型FMDV阳性血清发生特异性反应。证实,FMDV 2C′3AB基因在昆虫细胞中得到了表达,且表达产物具有良好的反应活性。

口蹄疫病毒P12A^＊3C基因转化饲草玉米高效表达载体的构建

为了研究饲草玉米可饲口蹄疫疫苗,将O型口蹄疫病毒的VP1和2A基因序列按照玉米的偏爱性密码子优化后,再与P1的其他基因及3C基因连接。同时,通过使用高效的Ubiquitin启动子以及在P1的起始密码子处添加Kozak序列和在3C基因3′末端添加内质网引导肽序列等措施提高免疫原基因的表达。结果显示,高效植物表达载体pC1300P12A*3C构建正确,可以用于后续的饲草玉米可饲口蹄疫疫苗的研究。

利用Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白的单克隆抗体建立单抗竞争ELISA方法

应用纯化的Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白作为抗原,采用过碘酸钠法标记纯化的单抗,建立了单抗竞争ELISA,检测10份阳性猪口蹄疫血清及200多份阴性血清,试验结果与样品的背景相一致。敏感性试验和重复试验结果表明,该方法具有稳定和敏感等特性,适合Asia1型猪口蹄疫病毒抗体的监测。

羊O／P液中AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因3′端序列的分析

从宁夏中卫AsiaⅠ型口蹄疫疫区的无临床症状羊采集的食道咽部分泌液（OPF）中扩增得到了4个口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因3′-端483bp（VP483）片段。核苷酸和氨基酸序列比较结果表明，从4份OPF中扩增出的VP1片段，在细胞受体结合位点处的关键氨基酸与目前公布的FMDVAsiaⅠ型流行毒相比均发生了改变，由RGD变成RDD。4个扩增片段的核苷酸序列与AsiaⅠ／js／WX／05株相比，同源性为96．2％～98、3％，表明与AsiaI／JS／WX／05株高度同源。蛋白结构模拟结果显示，这种改变会导致G—H环柔性减弱，这可能是AsiaⅠ／JS／WX／05FMDV适应羊体，造成持续感染后发生的一种变异。

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定

[目的]研究口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定。[方法]以含有FMDV 3ABC基因的质粒为模板,应用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因并进行序列测定,将3AB基因克隆至表达载体pET-28a(+),选取阳性克隆转化BL21感受态用IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定与W estern-bolt检测分析。[结果]经SDS-PAGE和W estern-bolt分析表明,在大肠杆菌中成功表达了3AB蛋白,表达的目的蛋白能与FMDV阳性血清发生特异性反应。[结论]该项研究为应用以重组FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫动物的鉴别诊断方法提供了依据。

口蹄疫病毒牛源整联蛋白受体β_3、β_8亚基基因的克隆及分子特征分析

本研究旨在从分子角度阐明口蹄疫病毒(FMDV)牛源整联蛋白受体β3和β8基因的结构特征,并为研究病毒遗传变异与宿主范围改变奠定基础。采用RT-PCR技术在国内首次从牛肾组织获得β3和β8基因,并用生物软件对它们的分子特征进行了分析。结果显示:β3亚基基因全长2 355bp,编码784个氨基酸,其中信号肽由22个氨基酸组成,胞外区由692个氨基酸组成,跨膜区由29个氨基酸组成,胞质区由41个氨基酸组成,氨基酸同源性与羊最高,与易感FMDV的牛、骆驼、猪和羊的β3亚基位于同一进化分支,各功能区的保守性为胞质区>跨膜区>配体结合区>胞外区>信号肽,但半胱氨酸富集区的突变率仅次于信号肽。牛源β8亚基基因全长2 304bp,编码767个氨基酸,包括42个氨基酸的信号肽,637个氨基酸的胞外区,29个氨基酸的跨膜区及59个氨基酸的胞质区,氨基酸同源性与马最高,进化分析发现与猪的β8亚基不在同一分支,各功能区的保守性排序为跨膜区>配体结合区>胞质区>胞外区>信号肽。将β3亚基与β8亚基比较发现,β8亚基的配体结合区比β3亚基更为保守,β3亚基的胞质区存在NPLY基序,而β8亚基无此基序,且β8亚基胞质区可变性更高。本研究提示FMDV对ανβ8的利用率高于ανβ3可能与β8亚基配体结合区更为保守有关。

副猪嗜血杆菌病原的分离鉴定与药敏试验

从数例疑似副猪嗜血杆菌病患病猪的肺脏和腹膜中分离到2株革兰氏阴性细小杆菌,经生化试验和PCR鉴定,确定分离的2株菌为副猪嗜血杆菌。药敏试验结果表明,分离株对诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星,以及头孢菌素、四环素和庆大霉素等药物敏感,对红霉素、壮观霉素和洁霉素有抵抗力。

O型与A型口蹄疫重组标记疫苗病毒株的制备及鉴定

为研制针对我国边境地区(尤其是西南边境)流行的A型口蹄疫(FMD)的标记疫苗储备病毒株,本研究通过化学合成东南亚地区流行的A型口蹄疫疫毒(FMDV)A/VN/03/2009株的P1基因,将其插入含FMDV编码非结构蛋白3A aa91-aa105位缺失的O/HN/93病毒全长重组质粒p OFS/3A_(91-105)中,构建FMDV A型和O型嵌合的全长重组质粒p O/3A_(91-105)-AP1。该重组质粒经NotⅠ酶切线性化后转染于表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞中,拯救得到FMDV重组病毒。间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定结果表明拯救的FMDV为正确的A型和O型间嵌合及3A aa91-aa105缺失的重组病毒。病毒蚀斑和一步生长曲线表明拯救病毒的感染性和复制能力稍低于其亲本病毒。该型间嵌合标记病毒的成功拯救为研制防控边境地区A型FMD的储备疫苗奠定了基础。

禽流感病毒H5N2亚型A/Chicken/Gansu/2003株HA+NA基因重组腺病毒的构建

目的基于腺病毒可感染禽类呼吸道和肠道上皮黏膜的特性,本文构建了包含有禽流感病毒H5N2亚型HA和NA基因的重组腺病毒,为进一步研制口服禽流感活载体疫苗奠定基础。方法通过RT-PCR方法分别扩增出AIV的HA和NA全基因片段,利用拼接接头将HA和NA定向串联并插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV之中,然后在大肠杆菌中实现腺病毒骨架载体pAdEasy-1和重组腺病毒穿梭载体的同源重组,获得插有外源基因的重组腺病毒质粒,进而通过转染HEK293细胞,得到含有目的基因HA和NA的重组腺病毒。结果在pAdTrack-CMV载体中成功克隆了HA+NA双基因,并与腺病毒骨架载体在大肠杆菌中实现了同源重组;线性化后的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后可观察到典型的细胞病变和绿色荧光蛋白的表达。结论成功获得了含有HA+NA双基因重的组腺病毒,为口服活载体疫苗的研制提供了依据。

朊毒体蛋白的构象及其特性的研究进展

概述了朊毒体（包括构象不同的细胞型朊毒体和瘁病型朊毒体）蛋白的构象特征、朊毒体及其突变体的特性，阐明了PrP^sc是由PrP^c通过构象转变而成的，不同物种PrP的三维结构有相似的球形结构域（125-228位）和N-末端无规卷曲尾，其球形结构域均由3个螺旋（144～154、173～194和200-228位）以及1对反平行的β-折叠（128-131和161-164）组成，但其结构和表面电荷分布存在一些区别。

鸡源鹦鹉热衣原体MOMP基因重组腺病毒的稳定性及SPF雏鸡免疫试验

目的:检测重组腺病毒质粒在HEK293细胞中的稳定性;重组腺病毒是否与减蛋综合征阳性血清发生中和反应,以及用重组腺病毒免疫SPF小鸡是否产生保护.方法:将重组腺病毒质粒在HEK293细胞中连续传代,并用PCR法检测目的基因;用减蛋综合征阳性血清在体外中和重组腺病毒,接种HEK293细胞;用重组腺病毒免疫SPF小鸡,然后用CpL菌株攻击.结果:重组腺病毒质粒在HEK293细胞中连续传代后,仍然用PCR检测能检测出目的基因;重组腺病毒与减蛋综合征阳性血清之间无交叉反应;用重组腺病毒免疫SPF鸡,用CpL菌株攻击,90%的小鸡获得了保护.结论:重组腺病毒质粒在HEK293细胞中能稳定传代;重组腺病毒不受减蛋综合征阳性血清的影响;用重组腺病毒免疫SPF小鸡,能够获得保护.

猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位

为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布。说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础。

山羊CLAⅠα链基因的克隆及生物信息学分析

为探究山羊CLAⅠα链基因的多态性,本试验根据GenBank中山羊CLAⅠα链基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从10个品系山羊白细胞中克隆山羊CLAⅠα链基因,测序后进行生物信息学分析。结果表明,CLAⅠα链基因长度为1 074bp,编码357个氨基酸。经核苷酸序列分析发现,10个品系山羊CLAⅠα链基因同源性集中在82.8%~99.5%之间。将10个品系山羊CLAⅠα链基因核苷酸推导的氨基酸序列进行比对,发现突变集中在α1区域(22—110位氨基酸)与α2区域(111—203位氨基酸)。遗传进化分析表明,GenBank中山羊CLAⅠα链基因与红寺湖绒山羊、河西绒山羊、陕北绒山羊、阿尔巴斯绒山羊的CLAⅠα基因遗传关系较近,与其他6个品系山羊,即简阳大耳山羊、金堂黑山羊、西农萨能奶山羊、美姑山羊、大足黑山羊、努比亚山羊的CLAⅠα基因遗传关系较远。本试验结果为进一步研究CLAⅠα链基因的多态性奠定了理论基础。