口蹄疫病毒2C′3AB基因重组杆状病毒的构建及其表达

将含有口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白2C部分基因编码区及3AB完整基因编码区的基因片段2C′3AB重组于杆状病毒穿梭质粒pMelBac-B,经PCR、酶切及序列分析鉴定正确后,命名为pMel-2C′3AB。将重组穿梭质粒pMel-2C′3AB与杆状病毒骨架共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选及PCR鉴定,构建了含有目的基因的重组杆状病毒。用该病毒感染High Five细胞,细胞裂解液的SDS-PAGE电泳结果显示,出现一约为43ku的蛋白带,与预期大小一致;Western-blotting结果表明,该表达产物能被FMDV阳性血清及2C′3AB单克隆抗体识别;间接ELISA结果显示,表达的目的蛋白能与牛、羊、猪的O型FMDV阳性血清发生特异性反应。证实,FMDV 2C′3AB基因在昆虫细胞中得到了表达,且表达产物具有良好的反应活性。

羊O／P液中AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因3′端序列的分析

从宁夏中卫AsiaⅠ型口蹄疫疫区的无临床症状羊采集的食道咽部分泌液（OPF）中扩增得到了4个口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因3′-端483bp（VP483）片段。核苷酸和氨基酸序列比较结果表明，从4份OPF中扩增出的VP1片段，在细胞受体结合位点处的关键氨基酸与目前公布的FMDVAsiaⅠ型流行毒相比均发生了改变，由RGD变成RDD。4个扩增片段的核苷酸序列与AsiaⅠ／js／WX／05株相比，同源性为96．2％～98、3％，表明与AsiaI／JS／WX／05株高度同源。蛋白结构模拟结果显示，这种改变会导致G—H环柔性减弱，这可能是AsiaⅠ／JS／WX／05FMDV适应羊体，造成持续感染后发生的一种变异。

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定

[目的]研究口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定。[方法]以含有FMDV 3ABC基因的质粒为模板,应用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因并进行序列测定,将3AB基因克隆至表达载体pET-28a(+),选取阳性克隆转化BL21感受态用IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定与W estern-bolt检测分析。[结果]经SDS-PAGE和W estern-bolt分析表明,在大肠杆菌中成功表达了3AB蛋白,表达的目的蛋白能与FMDV阳性血清发生特异性反应。[结论]该项研究为应用以重组FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫动物的鉴别诊断方法提供了依据。

O型口蹄疫疫苗免疫牛抗体消长动态的LPB-ELISA检测

分别按一次免疫、首免后第15 d加强免疫和首免后第60 d加强免疫程序,对3组试验牛(每组牛20头)用O型口蹄疫疫苗进行了免疫。免疫后不同时间点用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)测定了免疫牛O型口蹄疫抗体效价。结果,首免后第15 d加强免疫牛和第60 d加强免疫牛抗体水平较高,50%保护牛所占比例分别为56.3%和63.1%,完全受保护的牛所占比例分别为34.3%和29.5%。第60 d加强免疫牛的保护率要高于第15 d加强免疫牛和一次免疫牛的保护率。结果表明,首免后第60 d加强免疫是最理想的免疫程序。

病毒固有免疫识别受体研究进展

固有免疫应答是机体抵御病毒入侵的第一道防线,其前提则是病毒固有免疫识别受体对病毒感染相关模式分子的识别。目前病毒固有免疫识别受体主要是Toll样受体家族和RIG样受体家族的成员。现就这些受体的特征及其在识别病毒感染相关模式分子过程中的作用作一综述。

猪O型口蹄疫基因工程疫苗候选株的构建及其免疫原性分析

近年来,O型口蹄疫病毒已演化出多种谱系。目前应用的疫苗已不能有效保护多谱系口蹄疫的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,构建了含VP3(58位)和VP1(43、48、137、139、140、141和142位)氨基酸改造的全长克隆。线性化的全长cDNA和T7RNA聚合酶质粒共转染BHK细胞后获得拯救病毒。RT-PCR和乳鼠致病性试验表明拯救病毒遗传稳定,具有与亲本病毒相似的致病性。用拯救的基因工程病毒灭活疫苗免疫猪28d后分别用中国谱系、泛亚谱系和缅甸98谱系猪源毒的流行毒攻击,结果均获得了完全保护(16/16)。O/HN/93灭活疫苗免疫猪能完全保护泛亚谱系和缅甸98谱系猪源病毒的攻击(16/16),但不能完全保护(12/16)中国谱系猪源病毒的攻击。结果表明基因工程病毒制备的灭活疫苗提高了对中国型猪源谱系病毒的免疫保护,拓展了抗原谱,是具有良好开发前景的疫苗候选株。

应用BALB/c小鼠评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力

用不同剂量的口蹄疫灭活疫苗免疫3组雌性BALB/c小鼠,同时设空白对照组,每组8只。免疫后每7 d采血一次,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测血清抗体水平;第28 d用800LD50同源强毒攻击,攻毒后36 h,每组随机选取3只BALB/c小鼠,采全血,分别用每只BALB/c小鼠全血注射12只乳鼠,每组共注射36只乳鼠,以乳鼠试验判定BALB/c小鼠的病毒血症和攻毒保护情况。结果表明,免疫组BALB/c小鼠均可产生特异性抗体,保护率分别为75.0%、63.9%、36.1%;对照组小鼠血清抗体为阴性。提示,BALB/c小鼠可以用来评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。

口蹄疫病毒非结构蛋白定量检测ELISA方法的建立

目的:利用口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体建立液相阻断ELISA检测方法,进行定量检测口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白含量。方法:首先将工作浓度的3B单抗与待测病毒培养液过夜结合反应,然后取结合液转移至用3B蛋白包被好的酶标板上,用标准3B蛋白做12个梯度做对照,同时设阴性对照和空白对照。通过回归分析算出口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白3B含量。结果:回归曲线呈典型的S形,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R=0.99,检测范围为5～1500ng/ml,半数抑制浓度(Ic50)为130ng/ml。结论:该方法能特异、敏感的检测到病毒培养液中的非结构蛋白3B成分,并进行定量。

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。

口蹄疫病毒Asia 1/JSWX株基因组全长感染性克隆的体外拯救与序列分析

通过反转录聚合酶链反应,获得了口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JSWX株基因组3′端长片段(长约7.5kb)和5′UTR中ploy(C)前后的2个短片段。5′UTR的2个短片段经融合PCR扩增得到长约710bp的片段。用引物在基因组5′末端引入AflⅡ酶切位点和T7启动子,在5′UTR内引入SpeⅠ酶切鉴定位点,在3′末端引入NotⅠ酶切位点,将融合片段和3′端长片段顺次连接到载体pSL1180。经T7体外转录系统获取的RNA转录本与脂质体共转染BHK21细胞。测序结果表明,构建的病毒基因组全长cDNA为8 197nt,分别包括1个长为1 095nt的5′UTR[含有1个17nt的ploy(C)];1个长6 990nt的ORF;1个长为93nt的3′UTR;之后是18nt的poly(A)尾巴。该全长cDNA克隆与Asia 1/Jiangsu/China/2005株基因组序列的同源性为98.4%。测序和酶切鉴定结果均表明,该口蹄疫病毒株全长cDNA克隆已构建成功,该方法极大地简化了获得FMDV全长cDNA克隆的过程。通过反转录聚合酶链反应、间接免疫荧光试验和蚀斑试验等鉴定,本试验获得了感染性分子克隆;体外拯救获得的基因工程病毒连续传代培养后,可致BHK21细胞产生病变。上述结果表明,构建的cDNA克隆可以作为基因操作的载体,为深入研究安全性好、稳定性高和免疫原性强的基因工程疫苗奠定了基础。

三株重组VP1基因的泛亚1系口蹄疫病毒的蚀斑特性

利用反向遗传学技术,以PCR和盒式替换方法构建了3株含泛亚1系病毒的VP1基因序列的感染性克隆,转染BHK-21细胞,拯救3株口蹄疫病毒,进行蚀斑形成试验,并比较三者之间的差异。结果显示,在BHK-21细胞上,被拯救的病毒r-HK和r-ZheJ形成大斑,而被拯救的病毒r-NX则形成大小斑兼有的混合斑;在CHO-K1细胞上,r-HK和r-ZheJ不能形成蚀斑,而r-NX却能形成蚀斑。证实r-NX可以利用HS受体,而r-HK和r-ZheJ则不能利用HS受体,推测r-NX在BHK-21细胞上形成的小斑可能与病毒利用二类受体HS有关。

商品疫苗对FMDVO／YNGM／97株的免疫效果评价

利用血清学方法对我国流行毒株O/YNGM/97进行鉴定,并对其生物学特性和免疫学特性进行了研究。结果显示,该流行毒株为O型口蹄疫病毒(FMDV),其对乳鼠和BHK21细胞的适应性比较好,致病性较强,LD50和TCID50分别为10-6.33/0.2 mL和10-4.75/0.05 mL。VP1基因序列的比较结果显示,O/YNGM/97株与国外FMDV参考毒株O/TAI/1/92的同源性为91.4%,与国内疫苗毒株OZ/93、OA/58和OY/80的同源性分别为79.2%、83.6%和78.9%。用商品疫苗OZ株、OY株口蹄疫O型灭活疫苗和牛羊口蹄疫O-Asia1型双价灭活疫苗免疫的小鼠均可产生较高的免疫抗体,并对流行毒株O/YNGM/97的攻击具有较好的保护性。说明,使用现有商品疫苗完全可以预防该毒株在我国的流行。

FMDV非结构蛋白2C主要表位区与3AB基因的组合表达与活性分析

近年的研究表明,口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)2C在区分灭活疫苗免疫动物与自然感染动物方面具有潜在的价值,为了建立敏感性更高的鉴别诊断方法,将截取了2C蛋白N-端和C-端的主要B细胞表位区和完整3AB蛋白基因组合后,进行了原核表达,得到了分子量约为47.6kD的目的蛋白2C′3AB。通过Westernblotting分析证明,表达产物能被FMDV感染动物阳性血清识别,具有很好的反应性。以通过电泳纯化的目的蛋白作抗原进行间接ELISA检测不同来源的动物血清,结果表明,该抗原仅与感染动物血清具有很好的反应活性,而与健康动物与免疫动物血清无反应,说明重组蛋白2C′3AB可作为区分灭活疫苗免疫动物与感染动物的鉴别诊断抗原。用2C′3AB和3ABC为抗原进行间接ELISA,对比检测田间血清样品,结果显示2C′3AB-ELISA敏感性比3ABC-ELISA高。说明以重组蛋白2C′3AB作为鉴别诊断抗原,能进一步提高对临界值血清的检出率,这对区分灭活疫苗免疫动物与FMDV隐性感染动物与带毒动物具有非常重要的意义。

牛浮舰蛋白-2在真核细胞中的表达与鉴定

采用基因重组法将牛浮舰蛋白-2(Flotillin-2)基因的整个开放阅读框(ORF)克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-His(B),通过脂质体法将重组质粒转入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,利用Western-blot分析目的基因的表达情况。为确定35ku的小蛋白来源,采用融合PCR法构建突变体,分别利用标签抗体和针对浮舰蛋白-2的抗体鉴定突变体表达蛋白的特性。测序结果表明,成功构建了Flotillin-2基因的全长ORF及其突变体mFlotillin-2的重组质粒。Western-blot结果显示,Flotillin-2基因的全长ORF在CHO细胞中表达时除出现与预期大小相一致的48ku目的蛋白带外,还有1个35ku的条带。基因序列分析发现,在第430~438位核苷酸存在1个似Kozak序列(CGCATGGGC)。将ATG突变成GCT(丙氨酸)后,Western-blot结果显示,突变前后35ku的小蛋白始终存在。本研究以pcDNA3.1(-)/Myc-His(B)为载体,实现了牛Flotillin-2基因的全长ORF的真核表达,证明了35ku小蛋白并不是由于重新起始翻译导致的,而可能是浮舰蛋白-2在翻译过程中的裂解产物。

Dpl蛋白和PrP蛋白与Flotillins蛋白相互作用的酵母双杂交技术分析

为了确定Dpl蛋白和PrP是否与Flotillins蛋白相互作用,采用RT-PCR方法从牛睾丸组织中扩增出Dpl基因,从牛脑组织中扩增出PrP、Flotillins基因,应用酵母双杂交技术构建诱饵载体pGBKT7-Flo-tillins,捕获载体pGADT7-Dpl、pGADT7-PrP,然后验证Dpl蛋白和PrP蛋白是否与Flotillins蛋白相互作用。结果显示,成功构建了Flotillins蛋白的诱饵载体,Dpl和PrP蛋白的捕获载体;诱饵载体和捕获载体对报告基因无自激活作用,对酵母细胞无毒性。证明PrP与Flotillins在酵母水平有相互作用;Dpl与Flotil-lins在酵母水平没有相互作用。