哺乳动物性晚熟相关基因的研究进展

人和哺乳动物性的发育和成熟源于下丘脑性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,GnRH)脉冲式释放。GnRH释放受到抑制或破坏,就会导致性腺机能减退,人在发育前和发育期就会出现发育迟缓和性发育不良,表现为无精症或闭经;动物则表现为初情期延迟、生殖能力下降等表型。编码促性腺激素及其受体基因的突变可能引起哺乳动物性晚熟。笔者简要介绍了GPR54、GnRH/GnRHR、FSH/FSHR、LH/LHR基因与哺乳动物性晚熟的关系。

孕酮受体基因的研究进展

孕酮作为一种甾体激素,在各种雌性哺乳动物生殖活动中起关键作用。在人类和其他脊椎动物中,孕酮的生物活性主要是通过两个孕酮受体PGR-A和PGR-B转录活性的调节来介导。文章介绍了孕酮受体基因的结构、表达调控和多态性,并讨论了该基因与哺乳动物生殖功能的关系。

哺乳动物季节性繁殖的神经内分泌调节机制

动物的季节性繁殖,是指其繁殖活动从静止到复苏的一个年周期性循环。研究显示,kisspeptin和RFRP对繁殖的季节性变化具有重要作用。非繁殖期最显著的特点是雌激素对GnRH分泌的负反馈效应的增加,而雌激素的这种效应是由kisspeptin神经元传导的。因此,kisspeptin是影响繁殖活动的一个重要因子。RFRP的表达依赖于褪黑激素的分泌并呈现出季节性变化,在非繁殖期对繁殖活动的抑制作用非常明显。此外,甲状腺激素在繁殖期的终止上发挥着至关重要的作用,而多巴胺能神经元A14/A15也促进了雌激素负反馈效应的季节性变化。这些神经元系统通过协同作用一起调节了生殖功能随光周期的季节性转变。文章对繁殖的季节性和这4个神经内分泌系统之间的关系进行了系统的阐述。

骨形态发生蛋白15基因的研究进展

作者主要介绍了骨形态发生蛋白15的结构、功能与调控;骨形态发生蛋白15基因的结构、染色体定位,并讨论了该基因与哺乳动物繁殖性能的关系。

卵巢低氧微环境调节哺乳动物排卵的分子机制

哺乳动物排卵过程复杂,包括卵泡发育、卵泡成熟破裂后的排卵以及黄体形成和退化等过程。目前研究表明,排卵过程受低氧微环境和响应低氧条件的因子—低氧诱导因子(Hypoxic inducible factor,HIF)的影响。低氧调控HIF并影响许多生理过程,如血管生成、炎症反应等。尽管排卵的具体过程早已阐明,但低氧参与调控排卵过程的分子机制并不十分清楚。本文主要综述了哺乳动物在排卵过程中低氧环境如何产生以及HIF如何调控该过程的分子机制,旨在进一步理解排卵机制和卵巢的综合性功能,为相关的卵巢疾病提供一定的理论依据。

KISS-1/GPR54基因及其在生殖中的作用

KISS-1及其受体GPR54基因对青春期的正常启动具有重要作用。青春期开始前后,动物下丘脑中KISS-1和GPR54 mRNA水平很高,Kisspeptins(KISS-1基因产物)通过激活GPR54增加促性腺激素的释放,KISS-1基因的表达受性腺类固醇激素的调控。GPR54基因突变可以导致人和鼠的特发性促性腺激素分泌不足性腺机能减退症和促性腺激素依赖性性早熟。文章还介绍了KISS-1、GPR54基因的结构、表达、多态性以及和其它生殖调控因子之间的相互关系。

褪黑激素受体1A基因外显子2与小尾寒羊高繁殖力的关联

以褪黑激素受体1A(melatonin receptor 1A,MTNR1A)基因为候选基因,通过2种限制性内切酶(MnlⅠ、RsaⅠ),采用PCR-RFLP技术检测MTNR1A基因第2外显子主要序列在高繁殖力绵羊品种小尾寒羊中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明,MTNR1A基因外显子2的605位碱基处表现出MnlⅠ酶切多态性,在小尾寒羊中检测到3种基因型:MM(236 bp/236 bp)、Mm(236 bp/303 bp)、mm(303 bp/303 bp),MM和Mm基因型频率明显高于mm基因型频率。MTNR1A基因外显子2的604位碱基处表现出RsaⅠ酶切多态性,在小尾寒羊中检测到3种基因型:RR(267 bp/267 bp)、Rr(267 bp/290 bp)、rr(290 bp/290 bp),RR和Rr基因型频率明显高于rr基因型频率。复合基因型MMRR、MMRr、MmRR、MmRr的频率明显高于MMrr、mmRR、mmRr的频率,没有检测到mmrr复合基因型。小尾寒羊产羔数在MnlⅠ和RsaⅠ酶切复合基因型之间没有显著差异,但至少携带一个拷贝等位基因M的小尾寒羊比不携带M的具有稍微较高的产羔数,基因型为mm的小尾寒羊产羔数比其他基因型的小尾寒羊平均低0.26只。

山羊BMP15基因FecX^L突变的检测

采用PCR-SSCP方法在高繁殖力山羊品种(济宁青山羊、波尔山羊和文登奶山羊)和低繁殖力山羊品种(内蒙古绒山羊、安哥拉山羊和辽宁绒山羊)中检测骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,BMP15)基因的FecXL突变,同时研究该基因突变对济宁青山羊高繁殖力的影响。结果表明这6个山羊品种都没有发生与Lacaune绵羊相同的FecXL突变(C53Y)。可见BMP15基因中影响Lacaune绵羊高繁殖力的突变位点对济宁青山羊的高繁殖力没有显著影响。

转基因小鼠的多重PCR快速检测技术

转基因检测技术的标准化可以为转基因法规的制定和转基因产品的标识提供技术支持。采用碱裂解法快速提取鼠尾基因组DNA,用PCR方法检测其中的外源基因结构如cytomegalovirus(CMV)启动子、hGH polyA终止子及目的基因跨膜蛋白66(Transmembrane protein 66,Tmem66),筛选到阳性样品。优化了多重PCR引物退火温度及缓冲液浓度,并探讨了扩增速率对多重PCR的影响。结果表明,此多重PCR方法可得到很好的扩增效果,可用于转基因小鼠外源基因的检测,同时为哺乳动物检测标准的建立提供参考。

绵羊雌激素受体基因外显子4多态性分析

根据GenBank发表的人、鸡、大鼠雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因外显子4的序列设计1对引物,采用PCR-SSCP技术分析ESR基因外显子4在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊和湖羊)和低繁殖力绵羊品种(特克塞尔、中国美利奴、考力代和杜泊)中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明,ESR基因的此对引物扩增片段在所检测的6个绵羊品种中均不存在PCR-SSCP多态性,说明所检测的ESR基因外显子4序列比较保守,该区域可能不是影响绵羊高繁殖力的功能结构域。

猪前脂肪细胞为核供体生产表达绿色荧光蛋白的转基因克隆胚胎

分离培养了成年猪前脂肪原代细胞,并对前脂肪细胞向成熟脂肪细胞进行诱导分化,油红O染色法鉴定了脂肪细胞。利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP-N1转染前脂肪细胞,经过G418筛选获得了阳性细胞株。然后分别以前脂肪细胞、转绿色荧光蛋白(GFP)前脂肪细胞及胎儿成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植,结果表明:前脂肪细胞(8.8%)和胎儿成纤维细胞(8.3%)的囊胚发育率无显差异著(P>0.05);与前脂肪细胞相比,转基因前脂肪细胞的囊胚发育率降低,但差异不显著(3.7%vs.8.8%,P>0.05)。前脂肪细胞为核供体生产转基因克隆胚胎,能够获得转基因囊胚。虽然囊胚发育率不高,但为生产脂肪细胞转基因克隆猪奠定了基础。

4个绵羊品种PTGS2基因部分片段的多态性分析

设计2对引物,采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术检测前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)基因在小尾寒羊、湖羊、多赛特羊、萨福克羊4个绵羊品种304个个体中的单核苷酸多态性。结果表明,PTGS2基因引物1扩增片段在4个绵羊品种中不存在PCR-SSCP多态性。引物2扩增片段存在PCR-RFLP多态性,在4个绵羊品种中都检测到2种基因型(AA、AB),都没有检测到BB基因型。A等位基因频率明显高于B等位基因频率。小尾寒羊与多赛特羊、萨福克羊、湖羊之间PTGS2基因型分布差异显著(P<0.05),其余品种之间PTGS2基因型分布差异都不显著(P>0.05)。

猪IκBα基因定点突变中两种方法的应用

作者将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸,为进一步研究突变型IκBα蛋白对异种移植延缓性排斥反应的抑制机理奠定基础。首先采用Stratagene公司单点突变试剂盒将猪IκBα基因32位丝氨酸位点突变为丙氨酸,接着试图在36位引入突变但未成功,最后改用重叠延伸PCR对36位进行突变。结果表明,两种突变方法结合使用,成功地将猪IκBα基因32、36位丝氨酸位点突变为丙氨酸。说明两种突变方法各有所长,又有各自的缺点,应根据试验的实际需要灵活选择合适的突变方法,以收到事半功倍的效果。

小尾寒羊雌激素受体基因外显子4的克隆与序列分析

根据GenBank发表的人、鸡、大鼠雌激素受体（estrogen receptor，ESR）基因外显子4的序列设计1对引物，采用PCR技术扩增出小尾寒羊ESR基因外显子4的DNA片段，将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中，重组质粒用PCR扩增进行阳性克隆鉴定，然后测定其核苷酸序列并推导氨基酸序列，同时将测定的小尾寒羊ESR基因外显子4序列与人、牛、猪、大鼠、鸡的外显子4序列进行比较。结果表明：克隆测序所得的核苷酸和翻译后的氨基酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比，同源性分别为77．68％～97．28％和71．82％～98．18％，显示了很强的保守性；小尾寒羊的核苷酸序列与人、牛、猪、大鼠、鸡相比存在1处特有变异，氨基酸序列23～36存在高变异区。

猪NDUFS2基因的定位、克隆和组织表达谱分析

利用辐射杂种克隆板对猪NDUFS2(NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein 2)基因进行了染色体定位,克隆了该基因的CDS序列,用相关软件进行了基因结构和功能预测,并利用半定量RT-PCR对基因的组织表达谱进行了分析。研究结果表明:NDUFS2基因定位于猪的4号染色体SSC4q,与标记SW589紧密连锁。获得NDUFS2基因的CDS为1 392 nt,编码463个氨基酸。物种间系统进化树分析表明:猪与牛的NDUFS2基因序列同源性更高。结构预测发现猪NDUFS2基因具有一个NuoD保守结构域,与能量的产生和转化功能有关。根据组织表达谱分析结果,NDUFS2在猪的11种组织中的表达量有差异。

4个山羊品种BMP6基因部分片段的多态性分析

根据GenBank发表的绵羊骨形态发生蛋白6(bone morphogenetic protein 6,BMP6)基因部分序列所包含的外显子5、6、7和小鼠BMP6基因外显子5、6、7序列设计3对引物,采用PCR-SSCP技术检测BMP6基因外显子5、6和7在济宁青山羊、安哥拉山羊、波尔山羊、内蒙古绒山羊4个山羊品种250个个体中的单核苷酸多态性。结果发现这3对引物的扩增片段在检测的4个品种中均无多态性,说明所检测的BMP6基因外显子5、6、7序列比较保守。

猪TAF7基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

【目的】通过对猪TAF7基因初步的研究,为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息,为猪的遗传育种提供分子标记。【方法】以五指山猪为研究对象,克隆TAF7基因,分析该基因结构特点,然后利用IMpRH(the INRA-University of Minnesota porcine radiation hybrid,法国农业科学院-明尼苏达大学的辐射杂种克隆板)分析该基因在猪染色体上定位信息,利用半定量RT-PCR方法,分析该基因在成年五指山猪16个不同组织(心脏、背肌、淋巴、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、子宫、睾丸、胃、小肠、大肠、卵巢、胸腺、脑、脂肪)的表达谱信息。【结果】克隆得到长1701bp的五指山猪TAF7基因序列,其中包括1050bp完整CDS(Coding Sequence,编码序列)区域,分析表明其编码含349个氨基酸的蛋白质。利用IMpRH分析结果表明,猪TAF7基因与分子标记SW1879和IL4(interleukin-4,白细胞介素-4)紧密连锁,LOD(Limit of Detection,检测极限)值分别为6.69和6.15。组织表达谱分析结果显示该基因在大多数组织中均有表达,其中在睾丸表达量较高,而在心脏、背肌中表达很低。【结论】猪TAF7基因5’UTR中有一个短的内含子,而在该基因CDS区域没有内含子。猪TAF7蛋白序列与人TAF7蛋白序列的相似性较高,二者在生物系统发育树中的距离最接近。猪TAF7基因在大多数组织中均表达,在猪睾丸中表达量较高,证实它调节目的基因转录具有广泛性。

利用酵母双杂交系统筛选猪Calsarcin-1基因相互作用蛋白

【目的】利用酵母双杂交系统研究与猪Calsarcin-1相互作用的蛋白,了解Calsarcin-1在猪骨骼肌纤维类型形成和信号通路的调控功能。【方法】首先用长白猪Calsarcin-1基因构建既无自激活性又无毒性的pGBKT7-CS1诱饵载体;然后从猪的骨骼肌组织样中提取mRNA,利用SMART技术合成并纯化双链cDNA;最后通过酵母双杂交系统的共转化法筛选与Calsarcin-1相互作用的蛋白,在GenBank中比对分析相互作用基因,分析Calsarcin-1在骨骼肌中的功能。【结果】构建了pGBKT7-CS1诱饵载体,获得具有完整3′端的猪骨骼肌单链cDNA,并合成双链cDNA。筛选出4个与Calsarcin-1相互作用的蛋白,经与人的基因比较分析,发现Calsarcin-1与α-1肌动蛋白和α-3辅肌动蛋白互作,与骨骼肌Z线附近结构形成有关;与肌集钙蛋白-1和肌钙蛋白T3互作,影响钙离子的调控。【结论】分析所筛选出的蛋白功能,推测Calsarcin-1通过结合这些蛋白,维持细胞结构的稳定,影响相关蛋白的钙离子结合能力,从而参与钙离子调控;而钙离子浓度的变化将影响到其它控制肌纤维分化的因子,或其它调控通路,共同调节快慢肌纤维的形成与转化。