小反刍兽疫病毒H基因在杆状病毒中的表达及其免疫原性研究

为表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H蛋白,并探讨其免疫原性,通过RT-PCR克隆PPRV Nigeria75/1毒株H基因,将其克隆至供体质粒pFB-LIC-Bse中,测序验证后将重组质粒pFB-LIC-Bse-PPRV-H转化至DH10Bac感受态细胞中,经同源重组获得重组杆状病毒穿梭质粒bacmid-PPRV-H,将其转染昆虫细胞sf21获得含有PPRV H基因的重组杆状病毒。采用SDS-PAGE、Western blot、IFA及小鼠免疫试验鉴定表达产物的反应原性及免疫原性。结果表明,在杆状病毒表达系统中表达的PPRV H蛋白能与His-tag单克隆抗体及PPRV阳性血清发生特异性反应,其相对分子质量为68ku;表达产物接种小鼠可诱导其产生特异性抗体和抗小反刍兽疫病毒中和抗体,淋巴细胞增殖试验检测结果表明重组杆状病毒rBacmid-H能与相应抗体和致敏的效应淋巴细胞发生较强的特异性反应。本试验获得的重组杆状病毒表达的PPRV H蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,可诱导小鼠产生保护性中和抗体,该试验为进一步开发小反刍兽疫亚单位疫苗奠定了基础。

表达水泡性口炎病毒双血清型G蛋白重组腺病毒的构建及对小鼠的免疫原性分析

旨在以人5型复制缺陷型腺病毒为表达载体,构建表达水泡性口炎病毒(VSV)双血清型G蛋白的重组腺病毒。利用融合PCR技术扩增VSV-IN-G-NJ-G基因并将其克隆至腺病毒穿梭载体pacAd-CMV K-NpA中。通过PacⅠ酶线性化后,与同样经PacⅠ酶线性化的骨架载体pacAd5 9.2-100共转染AAV-293细胞,获得重组腺病毒rAd-VSV-IN-G-NJ-G。该重组腺病毒于AAV-293细胞连续传代至20代效价稳定。经间接免疫荧光和Western blot检测,G蛋白获得正确表达。将重组腺病毒接种小鼠,利用间接ELISA及病毒中和试验检测其体液免疫水平,结果显示可诱导产生VSV特异性抗体,其中和抗体水平在1∶32;利用淋巴细胞增殖试验检测细胞免疫水平,结果表明可以引起接种小鼠强烈的淋巴细胞增殖。构建的重组腺病毒免疫小鼠后可以引起一定的体液免疫和细胞免疫反应,为表达VSV糖蛋白重组腺病毒疫苗的深入研究奠定了基础。

表达水泡性口炎病毒G蛋白的重组腺病毒的构建与鉴定

为了以复制缺陷型人5型腺病毒为表达载体,构建表达水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IN)G蛋白的重组腺病毒,利用PCR扩增编码VSV-IN G蛋白的基因,并将其克隆至腺病毒穿梭载体pacAd-CMV K-NpA中;再将含有目的基因的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体质粒用PacⅠ酶切线性化后共转染AAV-293细胞,获得重组腺病毒rAd-VSV-IN-G。该重组腺病毒于AAV-293细胞连续传代至第20代效价稳定。间接免疫荧光试验和Western-blot检测结果显示,G蛋白在重组腺病毒中可以被正确表达。上述研究成果为VSV重组腺病毒疫苗的研制奠定了基础。