我国猪流感研究最新概况

猪流感(Swine Influenza,SI)是由正粘病毒科猪流感病毒(SIV)引起的一种急性、高度接触传染性的猪呼吸道疾病,临床以突发、咳嗽、呼吸困难、发热、衰竭、迅速康复或死亡为特征.该病呈地方性流行,可发生于各年龄和各品种猪,发病率高达100%.

马传贫病毒基因组转录图谱的研究

ＥＩＡＶ和ＨＩＶ－１、ＦＩＶ等病毒均属慢病毒属成员，这些病毒在基因组结构、复制的分子机制、抗原漂移及病毒与宿主的相互作用等方面都十分相似。在慢病毒基因转录过程中，首先形成一个与病毒基因组等长的ｍＲＮＡ，然后经过不同方式的拼接，得到长短不一的ｍＲＮＡ，进而出现核表达不同的蛋白。我们知道，慢病毒的基因表达受多种病毒蛋白及细胞核因子的复杂调控，这一过程的改变往往会影响病毒的致病力和繁殖能力。马传贫白细胞弱毒疫苗是目前唯一成功的慢病毒疫苗，因此比较 ＤＬＡ ＥＩＡＶ的拚接位点及拚接方式与其他毒株的异同，对于揭示 ＤＬＡ ＥＩＡＶ致弱的分子机制是十分必要的。本研究首先鉴定了 ＤＬＡ ＥＩＡＶ和 ＤＡ ＥＩＡＶ的几个拼接位点和几个转录产物，将这些拼接位点与已报道毒株相比较，发现 ＤＬＡ ＥＩＡＶ和 ＤＡＥＩＡＶ外显子３上游拼接位点为新发现的位点信号。同时，Ｒｅｖ的靶序列ＲＲＥ的核苷酸序列差异较大。在本研究试验条件下，未克隆到ＤＬＡＥＩＡＶ的１、２、４外显子拼接产物及ＤＡＥＩＡＶ感染动物细胞的１、４外显子拼接产物，这可能由于样品采集时间及病毒体内外繁殖环境差异造成的假阴性结果，但也有一种可能的情况。

两株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因诱导细胞凋亡的研究

为了研究H5N1亚型禽流感病毒NS1基因诱导的细胞凋亡作用,我们将两株H5N1亚型禽流感病毒A/Duck/Guangdong/40/2000(H5N1)(简称DKGD/40/00)和A/Duck/Guangxi/35/2001(H5N1)(简称DKGX/35/01)的NS1基因克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP,转染Hela细胞后,应用荧光显微镜检测转染表达效率,应用TUNEL和流式细胞仪观察NS1基因产生的细胞凋亡作用。结果两株病毒NS1蛋白表达均能诱导Hela细胞凋亡,凋亡率无明显差异。表明单一的NS1并不能完全阐明凋亡的产生与病毒毒力强弱和病毒扩散之间的关系。

H5N1禽流感病毒感染雏鸡免疫器官细胞因子的变化

为探讨细胞因子在禽流感免疫发病机制中的作用,应用细胞培养技术和细胞因子活性检测方法,通过对胸腺和脾脏IL-2、IFN和TNF3种细胞因子的检测,研究不同日龄(7和21日龄)SPF雏鸡感染禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)后,上述被检指标的动态变化,结果发现,无论是7日龄,还是21日龄SPF雏鸡感染AIV后,其免疫器官胸腺和脾脏的IL-2和IFN诱生活性均有不同程度的降低,而TNF活性升高;但不同日龄雏鸡之间被检细胞因子,其降低或升高程度不论持续时间还是量也不完全相同,该研究不但表明细胞因子在禽流感免疫、发病中具有十分重要的调节作用,而且也与雏鸡感染年龄存在一定相关性。

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒(NDV)强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V 基因全长cDNA,并引进相应的突变位点,将其克隆到pMD18-T载体,然后亚克隆到原核表达载体 pET-30c上,重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,筛选出阳性重组质粒,并命名为pET-30c-V。将 pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol／L IPTG 37℃过夜诱导表达,SDS-PAGE 及Western-blotting分析结果表明,所表达的NDV V重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子质量约28 ku,与理论值大小相符。将包涵体用8 mol／L脲变性,经Ni-NTA柱纯化,透析复性,得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡(300 μg／只),成功制备了抗鸡NDV V蛋白的抗血清。

兔多杀性巴氏杆菌热休克蛋白60基因的原核表达及抗原性分析

为了研究多杀性巴氏杆菌(P.multocida,Pm)热休克蛋白60(Hsp60)基因表达产物的抗原性,试验根据已发表的Pm 70株序列(AE004439)设计了1对引物,采用PCR技术扩增了兔多杀性巴氏杆菌C51-17株Hsp60的基因序列,将扩增产物与表达载体pPRO-EX-htb连接,得到重组表达质粒pHT-Hsp60,再用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定并测序确认正确后,将重组表达质粒pHT-Hsp60转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达,进行SDS-PAGE分析和Western-blot检测。结果表明:SDS-PAGE表达蛋白约为60 ku,与预期的Hsp60分子质量一致;表达产物与兔多杀性巴氏杆菌阳性血清发生特异性反应,说明表达产物具有良好的抗原性。

SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR法检测H5亚型禽流感病毒

用2株不同致病力的H5亚型禽流感病毒(AIV)感染Madin-Darby canine kidney(MDCK)细胞,收集感染后6,12,24,48,72 h的病毒,提取总RNA,利用Rotor Gene RG3 000实时定量PCR仪对H5亚型AIV的HA基因进行检测,试图建立快速检测H5亚型AIV的real-time RT-PCR方法,并用所建立的方法对来自全国各地的疑似H5亚型AIV的病料和咽喉拭子、泄殖腔拭子346份进行检测。结果表明：农业部动物流感重点开放实验室建立的HA基因的teal-time RT-PCR方法可以检测到细胞培养物中和临床样品中是否含有H5亚型AIV,与常规RT-PCR比较,该方法更加特异、准确、快速。

鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白多克隆抗体的制备及初步应用

以鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)LJS09株基因组为模板,应用PCR方法扩增gG基因的主要抗原性片段,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建pET-30a-gG-gG串联质粒,转化Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达及纯化,获得His-gG-gG重组蛋白,免疫新西兰大白兔制备抗血清。用ELISA检测抗体效价为1∶104。Western-blot分析结果表明,制备的家兔抗-ILTV gG抗体能与纯化的gG蛋白发生特异性反应,且能检测到内源性gG蛋白。间接免疫荧光试验结果表明,制备的家兔抗ILTV-LJS09gG蛋白的多克隆抗体分别能与ILTV LJS09、HLJ0507、MDJ0442、SD0203、Zhj1298株反应,特异性良好。