绿色荧光蛋白标记重组人偏肺病毒的制备

目的人偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）可致人上、下呼吸道感染。研究利用反向遗传学技术，以带绿色荧光蛋白（GFP）标记的hMPV NL／1／00全长cDNA质粒及4种辅助质粒pCITE-N、pCITE—P、pCITE—M2．1和pCITE—L为基础，在体外制备GFP标记的重组hMPV病毒（命名为rhMPV NL／1／00GFP）。方法采用LipofeetAMINE2000将带GFP标记的hMPV NL／1／00全长cDNA质粒以及蛋白表达质粒pCITE—N、pCITE-P、pCITE—M2．1和pCITE—L共转染BSR—T7细胞，3d后取BSR—T7细胞上清液感染Vero—E6细胞，1～4d后观察Vero-E6细胞出现明显细胞病变（CPE）和绿色荧光，持续观察至第10天。收集病毒上清用于病毒滴度检测。提取培养上清的病毒RNA并通过RT—PCR方法扩增病毒N基因、F基因和G基因验证所获重组病毒。结果Vero—E6细胞接种1～4d后观察到明显CPE和绿色荧光，随后CPE加重，荧光信号加强，持续至感染后10d；第1、5、10、15和20代病毒的滴度波动于10^5.0～10^6.5 TCID50／ml；RT—PCR检测出符合预期大小的910bp（N）、450bp（F）和980bp（G）条带，经上述片段cDNA序列测定和比对表明获得的重组病毒与hMPV NL／1／00原型病毒序列一致。rhMPV NL／1／00GFP重组病毒在体外传代20代后，遗传信号和荧光信号均稳定。结论采用反向遗传学技术成功拯救了具有感染性的重组hMPV病毒，为hMPV感染发病机制及疫苗研究奠定了基础。

绿色荧光标记重组人偏肺病毒空斑形成滴度测定方法的建立

目的 建立用于绿色荧光标记的重组人偏肺病毒（GFP-rhMPV）空斑形成滴度测定方法.方法 基因组中插入绿色荧光蛋白基因的hMPV全序列cDNA质粒和主要蛋白质表达质粒转入细胞293T后获得感染性重组hMPV.GFP-rhMPV在Vero-E6细胞中连续传代提升病毒滴度并保存.将等倍稀释的重组病毒液接种常规制备的Vero-E6细胞单层,用含或不含胰酶的低熔点琼脂精凝胶覆盖细胞,孵育一定时间后,采用荧光显微镜下计数荧光空斑数和抗原抗体蓝斑形成法计算病毒滴度.结果 感染后3 d,荧光显微镜下GFP-rhMPV可在低熔点琼脂糖凝胶覆盖层下形成分界较为清晰的绿色荧光集落,接种后3 d荧光空斑相对独立,便于计数.蓝斑形成法在感染后第5天蓝斑较大,易观察.此前拯救获得的GFP-rhMPV在宿主细胞Vero-E6中的复制滴度可达1×10^6 PFU以上.结论 成功建立了GFP-rhMPV的空斑形成实验滴度定量检测方法,为hMPV的致病机制、防治手段研究奠定了基础.