牛霉形体PCR检测方法的建立

参考GenBank中牛霉形体和无乳霉形体P81基因的序列差异,设计了针对牛霉形体P81基因的PCR引物,建立了牛霉形体PCR检测方法,并对该方法进行了敏感性和特异性试验。该方法可以从100ccu/mL(ccu:color change unit,颜色变化单位)的牛霉形体培养物中检出目的片段;经对丝状霉形体丝状亚种SC型(MmmSC)PG1株、丝状霉形体丝状亚种LC型(MmmLC)Y-goat株、山羊霉形体山羊亚种(Mccp)87001株、无乳霉形体(M.agalactiae)PG2株、绵羊肺炎霉形体Y-98株等亲缘关系相近的霉形体纯培养物检测,结果证实该方法具有良好的特异性。利用建立的PCR检测方法可以从人工感染牛的鼻拭子和临床发病牛肺中扩增出目的片段,与分离培养结果完全符合,本方法为国内首次建立的敏感、特异、快速的牛霉形体PCR检测方法。

猪肺炎支原体P97 C末端蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位分析

以大肠杆菌表达的pET-30a-P97C重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备针对猪肺炎支原体P97C末端蛋白的单克隆抗体,并将其与截短表达的P97C末端蛋白进行免疫印迹分析,初步鉴定了P97C末端蛋白的抗原表位。进一步采用肽探针扫描技术确定最小抗原决定区域,并通过生长抑制试验及抗黏附特性试验对抗原表位进行了分析。结果显示,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株A3C9和B4D5,并成功鉴定出P97C末端蛋白的2个独立线性表位F905PMAFSY911和G991TPNQGKKAE1000。2株单抗对猪肺炎支原体的生长均有一定的抑制作用,但对其黏附特性没有显著抑制作用。

牛霉形体免疫相关性蛋白P51的筛选与鉴定

为了筛选免疫原性蛋白,建立牛霉形体的快速诊断方法,利用二维凝胶(2-D)电泳、Western-blot分析及蛋白质谱分析,筛选出一个免疫相关性蛋白P51。以牛霉形体中国分离株Hubei-1为模板,扩增了p51基因,并克隆到原核表达载体pET32a上。结果显示,重组蛋白pET32a-p51与牛霉形体阳性血清的Dot-blotting试验结果为阳性,而Western-blotting试验结果为阴性。以pET32a-p51重组蛋白为包被抗原的ELISA试验表明其能与自然感染和人工感染牛霉形体的阳性血清发生特异性反应,而与灭活疫苗免疫的阳性血清不发生特异性反应,与牛传染性胸膜肺炎的阳性血清没有交叉反应。表明P51可能是牛霉形体特有的一种构象依赖性免疫相关蛋白,是一种有前景的诊断用抗原。