表达马传染性贫血病毒受体和荧光素酶报告基因的293细胞系的建立

为了在体外精确、简便地测定马传染性贫血病毒（EIAV）的中和抗体和研究不同毒株与受体的亲和性，克隆了马慢病毒受体1（ELR1）cDNA并插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建了表达载体pELR1。该载体瞬时转染293细胞后，经Western blot和间接免疫荧光（IFA）检测，确认了ELR1的表达。在pELR1质粒的基础上，插入EIAV疫苗株前病毒基因组转录调控区LTR以及萤火虫荧光素酶报告基因（Luc）构建了表达载体pELR1-LTR-Luc，并转染293细胞，建立了ELR1-LTR-Luc（293-E）细胞系。该细胞系能稳定表达ELR1基因，并且能在LTR的调控下表达萤火虫荧光素酶基因。用1000TCID50的EIAV驴胎皮肤细胞疫苗株D18V13接种该细胞，24h后检测其荧光素酶活性是未接毒对照的3．15倍。同时用IFA检测证明了病毒在细胞内的增殖。EIAV强毒株L21的接毒试验显示，ELR1．LTR（293-E）细胞的萤火虫荧光素酶活性与该毒株的接毒量在10^-2～10^-7稀释范围内呈正相关。该细胞系传35代后，外源基因的表达特征未发生改变。该细胞系的建立为进一步开展EIAV与细胞受体相互作用以及中和抗体评价等研究奠定了重要基础。

马传染性贫血病毒囊膜基因gp90V3区糖化回复突变感染性克隆的构建

为阐明我国马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)弱毒疫苗致弱及免疫保护的分子机制,作者分析了疫苗株及其亲本强毒株共34个囊膜基因序列。结果发现疫苗株在膜基因gp90 V3区的潜在N-连接糖基化位点出现稳定的碱基替换,使该位点消失。为研究囊膜糖基化的作用,以疫苗株全长感染性克隆pLG-FD3-8为亲本,利用反向遗传技术对该突变位点进行糖基化序列回复操作,构建全基因感染性克隆pLGFDg5。将pLGFDg5转染驴胎皮肤细胞(FDD),通过逆转录酶活性和RT-PCR方法评价其感染性。结果表明,将pLGFDg5在FDD细胞中盲传3代后,可在细胞培养上清中检测到逆转录酶活性,用RT-PCR检测到EIAV保守基因片段,在电镜下可见典型的EIAV粒子。在FDD细胞上的病毒复制动力学分析显示,与其亲本克隆pLGFD3-8的衍生病毒pLGFD3-V相比,回复突变克隆衍生的pLGFDg5-V复制速度较慢,获得较低的病毒载量。体外抗体中和试验表明,与其亲本pLGFD3-V相比,引入潜在的糖基化位点g5降低了衍生病毒对中和抗体的敏感性。这一结果为N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗致弱机理的作用研究提供了重要依据。