表达马传染性贫血病毒受体和荧光素酶报告基因的293细胞系的建立

为了在体外精确、简便地测定马传染性贫血病毒（EIAV）的中和抗体和研究不同毒株与受体的亲和性，克隆了马慢病毒受体1（ELR1）cDNA并插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建了表达载体pELR1。该载体瞬时转染293细胞后，经Western blot和间接免疫荧光（IFA）检测，确认了ELR1的表达。在pELR1质粒的基础上，插入EIAV疫苗株前病毒基因组转录调控区LTR以及萤火虫荧光素酶报告基因（Luc）构建了表达载体pELR1-LTR-Luc，并转染293细胞，建立了ELR1-LTR-Luc（293-E）细胞系。该细胞系能稳定表达ELR1基因，并且能在LTR的调控下表达萤火虫荧光素酶基因。用1000TCID50的EIAV驴胎皮肤细胞疫苗株D18V13接种该细胞，24h后检测其荧光素酶活性是未接毒对照的3．15倍。同时用IFA检测证明了病毒在细胞内的增殖。EIAV强毒株L21的接毒试验显示，ELR1．LTR（293-E）细胞的萤火虫荧光素酶活性与该毒株的接毒量在10^-2～10^-7稀释范围内呈正相关。该细胞系传35代后，外源基因的表达特征未发生改变。该细胞系的建立为进一步开展EIAV与细胞受体相互作用以及中和抗体评价等研究奠定了重要基础。

马传染性贫血病毒N-连接糖基化回复突变的感染性克隆构建

根据马传贫强毒株EIAV-L和疫苗株EIAV-FDD表面蛋白gp90的N-连接糖基化的变化规律,采用PCR定点突变的方法,对全长感染性克隆pLGFD3-8上的N-连接糖基化的差异区域进行改造后,构建成含有3个N-连接糖基化位点突变的感染性克隆pLGN191N236N246。将其转染驴胎皮肤细胞(FDD),通过用逆转录酶活性、间接免疫荧光和RT-PCR方法检测而确定其感染性。结果表明,在FDD细胞中盲传三代后,在细胞培养物中可检测到逆转录酶活性,RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈阳性,电镜下见到典型的EIAV颗粒。这一结果可能对N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗致弱机理的作用研究而奠定良好的基础。