兔出血症病毒TP株VP60基因DNA免疫小鼠的实验研究

为评价兔出血症病毒(RHDV)VP60基因在小鼠体内诱导产生体液免疫和细胞免疫情况,本研究构建了RHDV VP60基因的真核表达质粒pcDNA-VP60,并将其免疫小鼠。利用ELISA方法检测特异性抗体和小鼠外周血细胞因子水平,MTT法和流式细胞术(FACS)检测小鼠外周血T淋巴细胞增殖情况和T淋巴细胞亚群的动态变化。抗体检测结果显示,重组质粒免疫组抗体水平在免疫后5周～6周达到峰值,而且与对照组比较差异显著(p<0.05);细胞因子检测结果显示,重组质粒免疫组血清中IFN-γ、IL-2、IL-4因子水平随免疫时间延长而升高,并且能够维持较高水平,与对照组比较差异显著(p<0.05);T淋巴细胞检测结果显示,重组质粒免疫组T淋巴细胞明显增殖,CD4+T淋巴细胞数量免疫后明显增高,与对照组比较差异显著(p<0.05);所有检测指标显示重组质粒免疫组和灭活苗免疫组比较均无显著差异(p>0.05)。以上结果表明pcDNA-VP60重组质粒可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫,为研制预防兔病毒性出血症的候选DNA疫苗提供了实验依据。

白细胞介素-10研究进展

白细胞介素10(IL-10)是一种由多种细胞产生的免疫调节性细胞因子,主要生物学功能是限制和终止炎症反应,调控免疫细胞的分化和增殖。其对肿瘤的影响具有两面性,具较好的应用前景。论文就IL-10的生物学特性、在肿瘤模型中的作用研究进展做一综述。

白细胞介素18及其在禽类中的研究进展

白细胞介素18（Interleukin-18，IL-18）主要由单核-巨噬细胞系分泌，在结构上属于1L-1家族，在功能上与IL-12相似，而且与IL-12有协同效应，是重要的调节先天性免疫和获得性免疫的因子。IL-18除了能够明显诱导Th1、NK及NKT细胞产生IFN-γ外，还可诱导诸如IL-2、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）及肿瘤坏死因子（TNF-α）等其它多种细胞因子的产生。禽IL-18具有与人和哺乳动物相似的生物学功能，在抗微生物感染、抗肿瘤免疫等中具有应用潜力。

鸡抗病毒免疫相关的TLR信号途径研究进展

Toll样受体(TLR)是进化保守的模式识别受体家族之一,在启动和调节宿主对病原体的免疫应答中起重要的作用。已经报道在鸡体中发现了10种TLR,与哺乳动物的同源物相比,在进化中高度保守,能识别病原体中保守的组成成分,其中TLR3、TLR7和TLR 21主要识别核酸配体,在细胞内体上分布,在抗病毒免疫中尤为重要。论文主要对鸡TLR3、7和21在抗病毒免疫中的作用及信号途径进行综述。

犬瘟热病毒A株核衣壳蛋白基因的克隆、表达及特性分析

根据GenBank中A75/14株犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR从病毒总RNA中扩增出1600bp的N基因,将其克隆于pMD18-T载体对其进行序列分析。结果表明A株CDV与其它毒株N基因序列的同源性较高。将N基因定向克隆于原核表达载体pPROEXTMHT,用重组质粒pPROEXTMHT-N转化感受态E.coliDH5a细胞,用IPTG于37℃诱导表达了分子量约63Ku的重组N蛋白,占菌体总蛋白18%。经Westernblot分析证实所表达的重组N蛋白具反应活性,将表达产物用ProBondTM纯化试剂盒进行了纯化。用所获得的重组蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体可与CDV全病毒发生特异性反应,经琼扩试验测定其效价为1∶16。本实验为下一步用重组N蛋白作为诊断用抗原,建立特异的CDV抗体检测方法奠定了基础。

鸭肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表达

参照鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)的基因组序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法扩增获得了DHV-Ⅰ病毒161/79/V结构蛋白VP3基因,并将VP3基因片段插入pGEX-6p-1表达载体,转化E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS。SDS-PAGE分析表明,经用0.1mmol/LIPTG于16℃诱导表达后,菌体裂解产物有特异的、分子质量约52ku的目的蛋白条带。Western-blotting检测表明,表达产物与DHV-Ⅰ阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

3株鸭肝炎病毒Ⅰ型结构基因VP1的克隆及序列分析

通过RT-PCR方法扩增鸭肝炎病毒DHV-1：161/79/V、YH、HN株的VP1基因的核苷酸序列。系统发育分析表明,3株病毒与已发表的DHV-1结构基因VP1核苷酸和氨基酸的同源性分别为92.7%~96.9%和95.4%~96.6%,与DHV-1变异株核苷酸和氨基酸序列的相似性均分别低于75%和88%,表明3株病毒属于DHV-1,与变异株是不同的血清型。强毒DHV-1：161/79/V的VP1蛋白第49和第183位氨基酸为T和H,弱毒DHV-1：YH、HN为S和Q,推测这2处位点的改变可能与病毒的强弱有关 DHV-1和其变异株的VP1蛋白均没有保守的RGD序列 变异株N-DHV：90D、04G在第50和51位比DHV-1多2个氨基酸（Q和D）,在第147和185位各缺失1个氨基酸（E和L）,而在变异株DHV：AP-03337、AP-04009、AP-04114、AP-04203的第145和146位比DHV-1多了2个氨基酸（G、G） 不同血清型的鸭肝炎病毒在46-64位、95-149位、180-223位抗原指数差别较大,推测这些位点的改变可能影响病毒的生物学特性。

鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的表达及抗原性鉴定

为了对多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H(OmpH)的免疫学活性进行鉴定,本研究根据已发表的Pm70株序列(AE004439)设计了两对引物,用PCR方法扩增了鸭多杀性巴氏杆菌C48-102株的Omp H,扩增片段为1180bp(ORF为1056bp)。Omp H与GenBank中登录的C44-1、P-1059、P52、X-73、PM-70、serogroup D的序列比对结果表明:Omp H在核苷酸水平上同源性为82.8%～99.2%;在氨基酸水平上同源性为82.1%～99.1%。扩增去信号肽的Omp H基因,构建了原核重组表达质粒pHT-Omp H,转化BL21并诱导表达,SDS-PAGE结果表明:表达蛋白约为41ku,与预期的分子量大小相符;western blot结果表明具有良好的免疫学活性,这为以重组OmpH蛋白建立针对鸭Pm的血清学检测方法奠定了基础。

鸭肝炎病毒Ⅰ型结构基因vp1的原核表达及其抗原性分析

通过RT-PCR方法克隆出DHV-1:161/79/V结构蛋白vp1基因片段,将其克隆到pMD18-T载体中,测序结果为714bp。vp1经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+),获得重组质粒pET-VP1,转入E.coli Rosetta-gami(DE3) pLysS,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明在大肠杆菌中表达了1个相对分子量约为47ku的融合蛋白(Trx-His-VP1),将此融合蛋白用His-Ni+亲和层析法进行纯化。Western blot分析表明,Trx-His-VP1能与DHV-1阳性血清发生特异性反应,说明表达的结构蛋白VP1具有良好的抗原性。

MHC-B单倍型BW/G系鸡群同种异型抗血清的制备及应用

BW/G(n)系鸡群是主要组织相容性复合体核心区纯合的SPF鸡群,包括BW/G1、BW/G2、BW/G3、BW/G5、BW/G6和BW/G76个亚系,分别属于B13、B15、B2、B5、B21、B19单倍型。本研究以BW/G(n)系鸡的外周血红细胞作为免疫原,静脉接种其它不同单倍型鸡,制备了同种异型高免抗血清。参照经典的鸡血型鉴定方法,初步建立了单倍型鸡血型鉴定红细胞凝集方法,B13、B15、B5、B21、B2和B19的同种异型抗血清血凝效价分别为1∶80、1∶80、1∶40、1∶20、1∶16和1∶32,利用PCR对24只鸡的BF基因外显子2和3进行测序,确定其中22只为B5/B15杂合、2只为B15/B15纯合。利用制备的B15和B5抗血清分别对这24只鸡进行血凝试验,结果表明:B15抗血清与B5/B15个体的血凝效价为0～1∶160,与B15/B15个体的血凝效价分别为1∶80和1∶160;B5抗血清与B5/B15个体的血凝效价为1∶40～1∶80,与B15/B15个体的血凝效价分别为1∶10和1∶20。本研究制备的6种MHC单倍型鸡同种异型抗血清,为鸡的血型鉴定及免疫遗传基因纯合个体的筛选提供了物质基础。

鸡BLB重组蛋白的原核表达及多抗制备

为分析鸡主要组织相容性复合体(MHC)II类抗原β亚基BLB蛋白在鸡脾脏中的表达情况,本研究采用RT-PCR技术从鸡脾细胞中扩增了BLB基因的保守区第3外显子的部分序列,大小约为380 bp。将其克隆于表达载体pET-30a(+)中。在大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得大小约为19 ku以包涵体形式存在的His-BLB重组蛋白。切取含有重组蛋白的SDS-PAGE胶免疫实验兔,获得抗血清。以制备的血清通过western blot在鸡脾脏中检测到MHC II类分子特异性条带,其大小约为28 ku,与BLB天然蛋白的大小相符合。本研究为进一步分析MHC-II类分子在鸡体内的蛋白表达水平提供了依据。

汉坦病毒L基因的分段克隆及原核表达

为原核表达汉坦病毒(HV)L蛋白,本研究根据HV 76-118株全长L基因序列分段设计合成了6对引物。通过RT-PCR方法分段扩增L基因的6个片段,分别克隆于原核表达载体pET-30a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE分析表明,获得与预期分子量一致的特异的目的蛋白。Western blot检测表明,重组蛋白与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应。