禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究

用表达禽流感病毒 (AIV)核蛋白基因的杆状病毒感染Sf9昆虫细胞 ,以其表达产物制备抗原 ,建立了以杆状病毒系统表达的AIV核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术 (rNP_ELISA)。其抗原最适包被量为 0 .6 μg/孔 ,待检血清最适稀释度为 1:2 0 0 ,酶标抗体使用浓度为 1:10 0 0。根据对 140份SPF鸡血清检测结果的统计分析 ,确定其判定标准为OD值大于 0 .15的血清样品为阳性。用rNP_ELISA检测 15 0份SPF鸡血清、194份非免疫鸡血清及 30份其它 15种鸡疫病阳性血清均为阴性 ;检测A型AIV15个不同亚型 (H1～H15 )毒株的特异性血清均为阳性 ;对人工接种AIV的SPF鸡第 3天即能检出抗体 ,到第 16 2天试验结束时检测仍为阳性。其批内和批间重复试验的变异系数分别在 2 .9%～ 7.2 %和 3 .4%～ 9.8%之间。对3138份鸡血清进行监测 ,rNP_ELISA与全病毒间接ELISA(AIV_ELISA)、琼脂扩散试验 (AGP)及血凝抑制试验 (HI)的符合率分别为 99.9%、97.1%、98.8% ;并能 10 0 %检出AGP阳性及疑似、HI阳性的血清样品。试验证明 ,rNP_ELISA是检测A型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快速。

禽流感病毒抗原成份免疫活性的分析研究

用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ对纯化的禽流感病毒（ＡＩＶ）Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｕｋｒａｉｎｅ／１／６３（Ｈ３Ｎ８）进行分析，该病毒主要有１４种多肽成份。其中１１种成份可被ＡＩＶ多克隆阳性血清特异性识别，分子量分别为９５．７９ＫＤａ、７６ＫＤａ、７０．１ＫＤａ、６３．１７ＫＤａ、５８．７３ＫＤａ、５０．６２ＫＤａ、４４．５ＫＤａ、３１．８２ＫＤａ、２９．６７ＫＤａ、２３．６７ＫＤａ、１７．９６ＫＤａ，这些成份相对百分含量之和为 ８６．３３％；另有分子量为 ８４．５３ＫＤａ、１２．５０ＫＤａ和１０．０５ＫＤａ的三种多肽成份不具有抗原性。用０．０５％的ＮＰ－４０处理病毒蛋白作为间接酶联免疫吸附试验（间接－ＥＬＩＳＡ）、斑点－ＥＬＩＳＡ和琼脂凝胶扩散（ＡＧＰ）试验用抗原，能检出禽流感各亚型阳性血清，而与鸡新城疫（ＮＤ）、鸡马立克氏病（ＭＤ）、鸡传染性支气管炎（ＩＢ）、鸡传染性法氏囊病（ＩＢＤ）、鸡传染性贫血（ＣＩＡ）、鸡白痢（ＰＤ）、鸡鼻炎（ＩＣ）、鸡腺病毒感染（ＡＤＶ）、鸡减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）、病毒性关节炎（ＶＡ）、禽霍乱（ＦＣ）、鸡传染性喉气管炎（ＩＬＴ）、鸡白血病（ＡＬ）、鸡痘（ＡＰ），鸡慢性呼吸?

中药抗流感病毒研究概况

流感是一种动物及人类发病的传染性疾病,其病原属于正粘病毒科RNA病毒,由A型流感病毒属、B型流感病毒属、C型流感病毒属和类托高土病毒属组成,A型流感病毒感染人、猪、马、禽类及各种海洋哺乳动物.1997年和1999年禽流感病毒直接感染人事件发生后,禽流感作为人畜共患病得到人类的重新认识.

禽流感灭活疫苗的标准化研究

本文对我国禽流感灭活疫苗研制的现状、国际上标准化禽流感灭活疫苗的研究、禽流感疫苗标准化的必要性、研究和生产标准化禽流感疫苗硬件设施的需求、标准化禽流感疫苗用种毒和免疫佐剂的选择、标准化流感灭活疫苗中血凝素含量的测定、以及标准化禽流感疫苗生产中的关键技术问题等分别进行了论述,同时阐明了作者观点。

禽流感高免球蛋白的制备及应用研究

应用H9N2亚型禽流感病毒(AIV)油乳剂灭活苗6个不同剂量免疫30周龄SPF蛋鸡,通过血凝抑制(HI)和琼脂免疫扩散(AGP)试验监测血清及卵黄抗体消长规律,确定2.0 mL为最适免疫剂量。首免后第18天血清与卵黄中抗体同时升至第一高峰,此时加强免疫。二免后1周,效价达到第二高峰,用常规抽提法从高抗体滴度卵黄中提取高免球蛋白(IgY)。中和试验(NT)表明:IgY具有中和病毒感染的作用,且中和抗体滴度随HI滴度的降低而降低;给鸡肌肉注射后6 h能检测出血清的HI抗体,24 h达到峰值,维持7 d,第13天血清中HI抗体消失。104个EID50的AIV(H9N2)攻毒,同时用HI价为214的IgY的10倍系列稀释物分5组进行保护试验,确定HI价为214的IgY保护范围在100倍稀释与10倍稀释之间。IgY系列保护试验表明HI价28为完全保护的最低滴度;在攻毒的前1天及至攻毒后第5天接种IgY均能100%保护。攻毒保存期试验证明,所制得的高免球蛋白4 ℃可以保存6个月,-20 ℃可保存1年。

禽流感间接ELISA诊断试剂盒的研制及应用

将成熟的禽流感间接ELISA快速诊断技术试剂盒化 ,确定其外包装、规格、盒内组成 ,对盒内各组分的性状、保存、质量控制以及诊断试剂盒的特异性、敏感性、可重复性、符合率、与国外同类产品比较、保存期等进行了全面、详细的研究。试剂盒由 9种成套试剂组成 ,在 - 15℃至 - 2 0℃保存 5 40天各项性能仍然很好。该试剂盒与进口禽流感间接ELISA诊断试剂盒对同样血清样品检测 ,符合率为 10 0 %。拥有该试剂盒 ,只需准备生理盐水 ,即可对大量血清样品同时进行检测 ,操作简单方便、结果特异性强、敏感性高、稳定、快速 ,更适合于禽流感免疫抗体的监测及现地疫病诊断等需要。先后制备诊断试剂盒 16个批次 ,已成功应用于我国省、市兽医站、兽医研究所、农业院校、农科院、农业公司、口岸检疫部门及鸡场等各领域对禽流感的定性诊断、流行病学调查、免疫抗体监测等。

猪流感病毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从我国东北地区猪群中分离出 3株H3 N2 猪流感病毒 (SIV) ,分别命名为A/Swine/Heilongjiang/ 1/ 2 0 0 0、A/Swine/Heilogjiang/ 2 / 2 0 0 0和A/Swine/Heilogjiang/ 3/ 2 0 0 0。SIV分离株第 8代病毒液对 0 .5 %豚鼠红血球的血凝价分别为2 0 48log2 、2 0 48log2 、40 96log2 ;将其制成琼扩 (AGP)抗原与禽流感标准阳性血清均出现清晰白色沉淀线 ;与流感病毒H3 亚型标准阳性血清的血凝抑制 (HI)价分别为 8log2 、7log2 、7log2 ,但不能被鸡新城疫阳性血清抑制。这 3株SIV都为热不稳定型 ;均能凝集驴、绵羊、鸡、兔、豚鼠、小鼠、大鼠、人O型血红血球 ,对马、牛红血球均不凝集 ;感染一个病毒最小致死量的鸡胚平均死亡时间分别为 86 .4、12 9.6和 91.2小时 ;每 0 .2ml病毒液鸡胚半数感染量分别为 4.75lg、4.5lg、和 6 .0lg ;对鸡的静脉内接种致病指数和脑内接种致病指数各为 0 .5 6、0 .32、0 .5 2和 0 .77、0 .38、0 .5 2 ;对小鼠的半数致死量分别为 2 .6lg、2 .0lg和 2 .5lg ;试验感染小鼠、豚鼠和猪均可发病并出现死亡。存活动物接种后第 6天和第 14天的血清 ,其HI价均在 8log2 以上 ,而AGP均为阴性。

禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)全基因克隆及序列分析

本研究用无特定病原体 (SPF)鸡胚增殖禽流感病毒鹅体分离株A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1) (GD1/96 ) ,提取病毒基因组总RNA ,运用反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR)技术分别扩增该病毒分离株的 8个基因片段的cDNA ,分别克隆后进行序列测定。序列分析结果表明 ,所扩增到的 8个片段均包含相应的病毒基因的完整开放阅读框架。GD1/96株与 1997年香港禽流感事件中的 4株香港流感病毒分离株 (分别来自人、鸡、鸭和鹅 )的HA基因的高度同源性说明它们可能起源于同一种系 ,但NS基因的差异说明它们分属于不同的基因群系。GD1/96株与香港流感病毒分离株的核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性较低 ( 6 3.9%～ 98.1%) ,而香港流感病毒分离株之间的核苷酸和氨基酸序列的同源性很高 ( 96 .5 %～ 10 0 %) ,且香港各流感病毒分离株的NA均缺失 5 7个核苷酸 ( 19个氨基酸 )残基。因此 ,内地H5N1分离株GD1/96与

部分省市猪群猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离与鉴定

对黑龙江、吉林、辽宁、安徽、山东、内蒙、河南、河北、江苏、安徽、浙江、湖北、福建、广东、海南、上海等省、市猪群进行了猪流感的血清学和病原学调查研究。从 130 6份猪鼻棉拭子样品和死亡猪肺、气管样品中分离到 39株H3N2亚型猪流感病毒 ,12株 H1亚型猪流感病毒及其它亚型猪流感病毒 ,病毒粒子在透射电镜下呈现典型的正粘病毒特征 ,有囊膜和纤突 ,多为椭圆形、圆形、或杆形 ,直径约 80～ 12 0 nm。对 1997- 2 0 0 1年 3895份猪血清的血清学调查结果表明 ,近年中国多个地区猪群存在抗SWTN77(H1)、SWCO77(H3)、DKAT6 9(H1)、TKUK6 3(H3)流感病毒抗体 ;1998年来自河北的猪血清中抗 SWTN77阳性率高达 33.3% ;1999年来自内蒙的猪血清中抗 TKUK6 3和SWCO77阳性率分别为 13.3%和 2 6 .7% ;2 0 0 0- 2 0 0 1年调查的所有省市的猪群中均存在抗SWCO77抗体 ,阳性率从 3.2 %～ 10 0 %。说明近年我国猪群中

禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)NA基因的克隆及其重组禽痘病毒转移载体的构建

采用 RT- PCR技术扩增了禽流感病毒 A/ Guangdong/ 3/ 96 (H5 N1) [GD3/ 96 ]神经氨酸酶 (NA)基因 ,并将其克隆到 p UC18质粒中进行测序。核苷酸序列测定结果为 :NA基因全长为 14 10 bp,共编码 4 6 9个氨基酸。从 p UCNA中切下 NA基因片段 ,将其亚克隆到质粒 p SY5 38的 Eco R 位点 ,将带有痘苗病毒启动子 P11的 L ac Z基因平端克隆到该质粒的 Sm a 位点 ,然后切下同时含有 NA及 L ac Z基因的片段 ,再亚克隆到禽痘病毒载体 p SY6 81的 Not 位点 ,经限制性内切酶分析、PCR鉴定等 ,证明含有禽流感病毒 NA基因的重组禽痘病毒转移载体已构建成功 ,从而为进一步筛选表达 NA蛋白的重组禽痘病毒及探讨该蛋白的免疫原性奠定了实验基础。

H9亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫、免疫后攻毒及人工感染鸡抗体的监测

本研究采用ＡＧＰ、ＨＩ等试验方法，对经Ｈ９亚型禽流感油乳剂灭活苗免疫、免疫后攻毒以及经Ｈ９Ｎ２活毒人工感染后的ＳＰＦ鸡抗体产生、消长规律进行了测定，结果表明人工感染ＳＰＦ鸡和免疫鸡一周后，ＡＧＰ的检出率即可达到１００％；Ｈ９亚型禽流感油乳剂灭活苗自免疫后一周内即可产生ＨＩ抗体，２１－２８天达到高峰，并能对相同亚型病毒感染引发良好的免疫反应。

禽流感病毒重组核蛋白在琼扩诊断中的应用

利用杆状病毒表达禽流感病毒型特异性抗原－核蛋白，并就重组核蛋白作为禽流感琼扩诊断抗原地特异性和敏感性及作为抗原的其它特性进行了研究，并与普通全病毒琼扩抗原进行了应用比较试验，对３５４份现地可疑血清样品进行了检测，结果表明：该抗原可以特异性地定性检测出所有１５个禽流感病毒亚型的抗血清，与普通全病毒琼扩抗原的检测结果一致，但沉淀线更细密、清晰，保存方便；与我国广泛流行的１５种禽类其它病原体的抗血清没有任何交叉反应，表明该重组核蛋白作为禽流感琼扩抗原特异、敏感、生物安全性更可靠和生产成本更低廉，有利于进一步扩大禽流感疫情调查范围和加大监测力度。

表达H5亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶双基因重组禽痘病毒的构建

血凝素（ＨＡ）和神经氨酸酶（ＮＡ）是禽流感病毒（ＡＩＶ）的两种表面糖蛋白，主要诱导机体产生体液免疫应答。本研究采用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取禽流感病毒分离株Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／３／９６（Ｈ５Ｎ１）的ＳＰＦ鸡胚尿囊毒ＲＮＡ，ＲＴ－ＰＣＲ扩增完整的ＮＡ ｃＤＮＡ基因，将其克隆到载体ｐＳＹ５３８中的禽痘病毒早晚期启动子 ＬＰ２ＥＰ２的下游，然后再将含有启动子的 ＮＡ基因片段亚克隆到已有的ＡＩＶＨＡ基因重组禽痘病毒转移载体ｐＳＹ（ＨＡ＋ＬａｃＺ）中，构建了ＨＡ、ＮＡ双重组禽痘病毒转移载体ｐＳＹ（ＨＡ＋ＮＡ＋ＬａｃＺ），将它与禽痘病毒疫苗株Ｓ－ＦＰＶ－０１７共转染鸡胚成纤维细胞，在Ｘ－ｇａｌ存在的条件下，经蓝斑筛选、六选蚀斑纯化、ＰＣＲ鉴定等，结果表明已获得一株能同时稳定表达ＨＡ和ＮＡ蛋白的重组禽痘病毒，为禽流感基因工程病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。

H9亚型禽流感病毒分离株A/Chick/Shandong/6/96的基因序列分析

对 1株H9N 2亚型禽流感病毒 (AIV)A/Chick/Shandong/ 6/ 96(H9N2 )进行了全病毒基因序列分析。结果表明 ,该毒株 8个基因的核苷酸序列皆与 1994年分离株A/Chicken/Beijing/ 1/ 94(H9N2 )具有很高的同源性 (96.0 %—98.6% ) ;推导其血凝素 (HA)裂解位点处的氨基酸序列为A R S S R ,完全符合H9AIV欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/ 1/ 94亚分支的特征 ;虽然其神经氨酸酶 (NA)基因与A/Chicken/Beijing/ 1/ 94(H 9N2 )相比 ,出现了 9个核苷酸的缺失 ,然而其同源性仍然较高 ,为 97.3 % ;而与欧亚分支中的类A/Chicken/Korea/ 3 2 3 / 96和类A/Quail/HongKong/G1/ 97亚分支的同源性却相对较低 ,分别为 92 .0 %和 84.2 % ;其它基因的比较情况也大体相近。提示该毒株是由 1994年分离株进化而来 ,在遗传演化上属于H9亚型流感病毒欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/ 1/ 94(H9N2 )亚分支。