TaqMan探针实时定量PCR检测肉中单增李斯特菌的研究

根据GenBank公布的单增李斯特菌的hlyA基因序列设计一对引物和一条TaqMan探针,在分析特异性基础上,构建阳性重组质粒进行荧光定量PCR扩增,制备标准曲线,分析敏感度。进一步将该方法应用到人工染菌肉样中,分析其最低检出限。结果表明,该方法对10株单增李斯特菌均可产生特异性扩增曲线,其他6株非单增李斯特菌不产生扩增曲线,表明该方法具有较强的特异性。对阳性重组质粒定量扩增所建立标准曲线的相关系数为0.998,敏感度为19.5 copies.μL-1。该法对人工染菌肉样中单增李斯特菌的最低检出限为2.8×102cfu.g-1。该方法特异性强、敏感性高,可为肉中单增李斯特菌的快速、准确的定量检测奠定基础。

抗Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体表位的鉴定

为了筛选Ⅰ型鸭肝炎病毒(Duck viral hepatitis typeⅠ,DVH-Ⅰ)VP1蛋白的抗原表位,试验应用噬菌体展示随机12肽库试剂盒,以抗DHV-ⅠVP1蛋白单克隆抗体纯化IgG作为靶标,通过ELISA和竞争抑制ELISA鉴定筛选克隆的结合特性,并对阳性克隆提取DNA进行测序分析。结果表明:通过3轮生物淘洗后,目标噬菌体得到282倍富集;随机挑选15个克隆进行测序分析及ELISA和竞争抑制ELISA检测,其中有8个噬菌体克隆可以与抗DVH-ⅠVP1蛋白单克隆抗体高度特异性结合,8个克隆的共有氨基酸序列为GMMIP。说明共有序列GMMIP可能是单克隆抗体2D5所识别的VP1蛋白的线性表位。

新Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1和3D蛋白的原核表达及鉴定

为表达新I型亚肝炎病毒(DHV-1C)的VP1和3D重组蛋白,本研究根据GenBank中的DHV-1C N株全基因序列,设计合成两对引物扩增其VP1和3D基因,构建重组表达载体并进行诱导表达。SDS-PAGE和western blot分析表明,VP1和3D重组蛋白分别在诱导3 h和4 h后表达量达到峰值,其大小分别为37.68 ku和65.80 ku,并且能够与抗DHV-1C阳性血清产生特异性免疫反应。

TaqMan探针实时定量PCR检测肉中金黄色葡萄球菌的研究

根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌的nuc基因序列设计一对引物和一条TaqMan探针,在分析其特异性基础上,构建阳性重组质粒进行荧光定量PCR扩增,制备标准曲线,分析方法的敏感度。进一步将该方法应用到人工染菌肉样中,分析其最低检出限。结果显示该方法对5株金黄色葡萄球菌均可产生特异性扩增曲线,其他6株非单增李斯特菌不产生扩增曲线,表明该方法具有较强的特异性。对阳性重组质粒定量扩增所建立标准曲线的相关系数为0.997,敏感度为1.87×101拷贝.μL-1。该法对人工染菌肉样中金黄色葡萄球菌的最低检出限为2.0×102cfu.g-1。该方法特异性强、敏感性高,可为肉中金黄色葡萄球菌的快速、准确的定量检测奠定基础。

牛分枝杆菌分枝菌酸环丙烷合酶PCAA的表达与鉴定

以牛分枝杆菌Vallee株基因组为模板,利用PCR方法扩增该菌株的环丙烷-分枝菌酸合酶pcaA基因,并克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,通过大肠杆菌BL21(DE3)表达重组融合蛋白,并利用Ni-亲和层析的方法纯化出重组蛋白。通过鉴定其免疫活性。试验结果表明,成功扩增出了牛分枝杆菌中pcaA基因并纯化出了重组的融合蛋白,通过免疫印记发现,重组蛋白可与牛结核阳性血清发生特异性反应,为进一步研究牛分枝杆菌的致病机理奠定基础。