应用重组抗原建立检测牛传染性胸膜肺炎的间接ELISA方法

目的丝状支原体丝状亚种SC(MycoplasmamycoidessubspmycoidesSC,MmmSC)是引起牛传染性胸膜肺炎(contagiousbovinepleuropneumonia,CBPP)的病原体。成熟的脂蛋白LppQN端是亲水性的,在自然感染和人工感染时,特异性免疫反应产生早,持续时间长,抗体滴度高,因此有理由相信脂蛋白LppQN端片段将有可能成为一种理想的CBPP诊断抗原。方法由于TGA密码子在支原体中编码色氨酸(Trp),而在细菌中则为终止密码子,故利用一步重叠延伸PCR突变方法体外诱变中国生产抗原用毒株HVRIⅩ的lppQ基因进行原核表达,利用重组抗原建立间接ELISA方法。结果序列分析表明,将lppQ基因第198位的A成功突变为G,并将突变后的脂蛋白LppQN端基因片段插入原核表达载体pET32a的多克隆位点,构建了原核表达载体。重组菌经诱导后,表达出了分子量约为42kD、带有6个组氨酸标签的重组融合蛋白,纯化后蛋白质纯度高达95%,Westernblot结果显示,重组蛋白具有很好的免疫活性。将纯化的蛋白质稀释至0.35μg·ml-1,包被酶标反应板,优化反应条件,P/N为4.8(0.934/0.193)。应用TG-ROC统计软件分析确定阴阳性血清临界OD值为0.376,敏感性为95.8%(46/48),特异性为98.9%(161/163)。应用间接ELISA和补体结合试验(CFT)对来自3个省自治区3817头份牛血清进行了检测。结论Kappa值为0.63,两种方法存在中、高度一致性。

猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定

以肺炎霉体体(Mhp)Yin-1株为模板,利用所合成的引物扩增了伴侣蛋白DnaK(热休克蛋白Hsp70)C末端基因,将得到的目的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,原核表达获得了重组蛋白6P-1-DnakC和28a-DnakC,经Western-blot分析,均能被Mhp抗血清识别。以28a-DnakC作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,以6P-1-DnakC为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠。筛选和鉴定了2株分泌抗DnaK的杂交瘤细胞株,命名为1AD10、2AF11。Western-blotting结果表明,这2株单抗与Mhp发生特异性反应而不与其他相关霉形体发生反应。抗体亚类鉴定结果显示,1AD10、2AF11分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为κ链。相加ELISA试验表明,2株单抗能识别不同的抗原表位。

丝状支原体丝状亚种SC型中国不同地区分离株脂蛋白Q基因的分子特征

根据已发表的丝状支原体丝状亚种SC型(MmmSC)脂蛋白Q(LppQ)基因序列设计并合成一对引物,利用PCR扩增方法,从我国不同省区的MmmSC分离株HVRI-Ⅹ、BenⅠ、QingⅠ、MuⅠ和模式株PG1中获得了LppQ基因1303bp的片段,将该片段克隆到PMD18-T载体上,通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定,证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒。采用Sanger's双脱氧末端终止法对插入片段进行核苷酸序列测定,获得了HVRI-Ⅹ、BenⅠ、QingⅠ、MuⅠ株和模式株PG1LppQ基因核苷酸序列。核苷酸序列比较结果显示,国内4个MmmSC分离株与GenBank公布的LppQ基因核苷酸序列同源性均在99.7%以上,氨基酸序列同源性均在99%以上;与模式株PG1的核苷酸序列同源性在99.7%以上,氨基酸序列同源性均在99.3%以上。国内4个MmmSC分离株之间的核苷酸序列同源性均在99.7%以上,氨基酸序列同源性均在99.3%以上。对HVRIⅩ株LppQ基因氨基酸亲水性和蛋白表面可能性进行了分析,证实LppQN末端富含亲水氨基酸,比C末端更有可能定位在蛋白表面。

丝状支原体丝状亚种SC型中国分离株分子流行特征

收集了6个来自不同地方中国历史流行的丝状支原体丝状亚种SC型(Mycoplasma mycoidessubsp.MycoidesSC,MmmSC)毒株与PG1、Y-goat进行分子特征比较。全菌体蛋白电泳与PG1完全相同,而与Y-goat不同;PCR结果显示6个中国分离株与PG1、Y-goat都没有缺失8.84 kb片段;LppB全基因序列比较发现与PG1同源性达99%,而与Y-goat同源性很低;多位点基因序列类型(Multilocus sequence types,MST)分析显示与非洲澳大利亚群完全相同。以上证据显示中国CBPP流行株应归属于非洲澳大利亚群。

丝状霉形体丝状亚种SC型脂蛋白LppQN末端基因克隆与序列分析

脂蛋白 L pp Q是丝状霉形体丝状亚种 SC型 (Mm m SC)非洲株、欧洲株和疫苗株所特有的。 L pp Q N末端域具有良好的免疫原性 ,在牛体内可诱导产生强大、特异、早期、持续的免疫反应。本研究根据已发表的 L pp Q基因序列设计引物 ,用 Pyrobest TM高保真 DNA聚合酶从 Mmm SC HVRI X株中扩增出了 L pp Q N末端基因序列 ,并进行了克隆与序列测定。核苷酸序列比较结果显示 ,HVRI X株的 L pp Q N末端基因序列与国外发表的序列同源性为 99.7% ,由其推导的氨基酸序列同源性为 99.1% ,为脂蛋白 L pp Q

丝状支原体丝状亚种SC型脂蛋白Q的N末端定点突变及表达载体的构建

根据已发表的丝状支原体丝状亚种SC型(MmmSC)LppQ基因序列设计引物,从MmmSC HVRI X株中扩增出了LppQ N末端基因,并将其分别克隆到pUC18和pUC19上,利用一步重叠延伸PCR突变方法将其66位的TGA突变为TGG,经克隆与序列测定证实突变成功后,将已突变的LppQ N末端基因插入原核表达载体pET32a的多克隆位点,成功地构建了LppQ N末端基因原核表达载体pET32a-LppQ,为其下一步体外表达奠定了基础。

丝状支原体丝状亚种SC型脂蛋白QN末端基因的表达、纯化与抗原性分析

为了表达丝状支原体丝状亚种SC型(MmmSC)中国分离株HVRIⅩ脂蛋白Q(LppQ)N末端基因,将该基因经PCR扩增后克隆至原核表达载体pET32a中,经酶切、PCR、测序证实获得了重组表达质粒,转化Escherichia coliBL21(DE3)菌,经IPTG诱导后获得可溶性融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的53.7%,用Ni-NTAHis.Bind纯化试剂盒纯化后,蛋白纯度达95%以上。表达蛋白经Western blot检测其抗原活性,结果表明纯化蛋白可与CBPP标准阳性血清发生强烈的反应,而与阴性血清不发生反应。