采用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感疫苗株

目的构建重组H5亚型禽流感疫苗株。方法采用RT-PCR技术,分别扩增鹅源高产禽流感病毒A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)的6条内部基因片段、高致病性禽流感病毒株A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)的血凝素(HA)基因和N3亚型参考株A/Duck/Germany/1215/73(H2N3)的神经氨酸酶(NA)基因,并对HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸(R-R-R-K-K)的编码序列进行缺失与修饰,然后分别构建这8个基因的转录与表达载体,将其共转染293T/MDCK混合培养细胞单层,对拯救出的重组病毒进行表型分析。结果利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽流感病毒的疫苗株,其基因序列符合设计要求包括删除HA基因的毒力相关序列,疫苗株的表型为H5N3。结论构建成功重组禽流感疫苗株rH5N3,为制备H5亚型禽流感疫苗打下了坚实的基础。

重组禽流感疫苗株rH5N3的生物学特性与免疫效果

目的评价重组禽流感疫苗株rH5N3的生物学特性和免疫效果。方法将rH5N3注射SPF鸡胚和SPF鸡,观察其致病性;rH5N3及其亲本毒株A/Goose/HLJ/QFY/04分别在MDCK细胞单层和SPF鸡胚中增值,研究其生长特性;rH5N3在SPF鸡胚中连续传代,测定第10代rH5N3的核酸序列,评价其遗传稳定性;制备油包水型灭活rH5N3疫苗接种SPF鸡,免疫后不同时间采血测HI抗体滴度;rH5N3灭活疫苗接种SPF鸡,免疫后3周采血测定HI抗体滴度,同时进行H5N1亚型强毒株攻击,观察其保护作用。结果rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性;其在鸡胚尿囊液和细胞培养上清液的HA效价极大提高,分别为1:2048和1:512;第10代rH5N3的核酸序列与其亲本毒株相同;灭活rH5N3疫苗免疫鸡后2周即可诱导产生高效价HI抗体,且免疫后18周依然保持较高水平;该疫苗对强毒株包括国内早期分离的A/Goose/Guangdong/1/96和近期分离的A/Goose/HLJ/QFY/04都能产生完全的保护作用,免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。结论rH5N3疫苗株具有安全、高产、稳定等特点,且具良好的免疫原性,免疫动物完全能够抵抗强毒株的致死性攻击。该疫苗株的成功研制为H5N1亚型高致病性禽流感的防控提供了新的技术保障。