中国花生核心种质中高油酸材料的分布和遗传多样性

利用代表花生基础资源的核心种质分析花生高油酸资源的分布和遗传多样性,结果表明:在花生核心种质中油酸含量高于57%的种质40份,主要分布在密枝亚种(普通型25份和龙生型8份),少数分布在疏枝亚种(珍珠豆型6份和中间型1份);除了10份资源来源于国外(ICR ISAT 7份,美国1份,日本1份和韩国1份),其他种质资源来源于中国12个省市。同时发现高油酸种质中3份资源的粗脂肪在55%左右,分别是Zh.h4094(油酸66.70%,粗脂肪54.99%),Zh.h4029(油酸63.50%,粗脂肪55.58%)和Zh.h4319(油酸59.70%,粗脂肪56.04%);基于植物学和产量性状分析,前5个主成份(PC)可以解释81.17%的变异。聚类分析表明,在阈值为0.1942时,可分为8个组。因此中国花生核心种质中高油酸种质存在丰富的遗传多样性,而且分布较广,高油酸种质的获得为花生高油酸育种提供基础材料。

中国花生小核心种质SSR遗传多样性

从206对SSR引物中筛选26对引物对我国花生全套小核心种质298份资源进行了遗传多样性分析,相似系数为0.51～0.99,其中种质zhh1497与zhh1398遗传差异最大。检测到3个在不同植物学类型中特异表达的标记带型,包括普通型1个(2A06/440),龙生型1个(2A06/440),珍珠豆型1个(PM443/270),多粒型2个(PM443/270,9E08/500)。分析结果表明,多粒型花生的多态性信息量和遗传多样性指数均最大,平均相似系数最小,其次是普通型花生,龙生型和中间型花生的多态性信息量和遗传多样性指数均较小,平均相似系数较大。在我国花生小核心种质中,国外引入资源的多态性信息量和多样性指数均高于我国本土资源的对应值。在我国本土花生资源中,长江流域和南方地区资源的多态性信息量和遗传多样性指数均高于其他地区。

ICRISAT花生微核心种质资源SSR标记遗传多样性分析

【目的】评价ICRISAT花生微核心种质资源的遗传多样性水平,揭示ICRISAT花生微核心种质资源遗传多样性,验证传统植物学分类的可靠程度,为充分发掘、利用ICRISAT花生微核心种质资源提供必要信息。【方法】采用27对花生SSR引物,对ICRISAT微核心花生种质168份材料(来自世界五大洲42个国家)进行遗传多样性分析;利用NTSYS-pcV2.0软件进行主成分分析(PCA)并绘制三维空间聚类图;利用Popgene V1.32估算种质群间的Nei78遗传距离等参数并进行UPGMA聚类分析,采用MEGA3.1绘制种质群间聚类图。【结果】27对SSR引物共扩增出115条多态性条带,每对引物平均扩增出4.2930个等位变异,其中有效等位变异数2.7931,有效等位变异所占比重为65.49%;PM137、16C6、14H6、8D9和7G02等引物最为有效,其Shannon’s信息指数均在1.5以上,等位变异数5个以上,有效变异数3.7个以上。在多粒型群体中,来源于南美洲和印度种质资源的遗传多样性较低,来源于南美洲和非洲种质资源的遗传多样性较高;在珍珠豆型群体中,来源于北美洲种质资源的遗传多样性较低,来源于南美洲和非洲种质资源的遗传多样性较高;在普通型群体中,来源于北美洲种质资源的遗传多样性较低,来源于南美洲、美国和非洲种质资源的遗传多样性较高。来自南美洲的花生种质资源具有较高的遗传多样性,与花生起源于南美洲的结论一致。PCA分析,发现栽培种花生种质资源由4个差异明显的基因源构成,"hypogaea"包括普通型种质资源,"vulgaris"包括珍珠豆型种质资源,"fastigiata1"包括多粒型种质资源,"fastigiata2"包括多粒型种质资源。植物学分类单位间的Nei78遗传距离介于16.336—23.607cM,UPGMA聚类方法将花生属植物学分类单位聚成5个组群,"组群1"对应"hypogaea"基因源,"组群2"对应"vulgaris"基因源,"组群3"对应"fastigiata1"、"fastigiata2"基因源之和,"组群4"和"组群5"分别代表秘鲁型和赤道型基因源,聚类结果支持4个基因源的划分。【结论】ICRISAT花生微核心种质资源具有丰富的遗传多样性,不同来源的变种群间存在明显的遗传差异,并分化成4个基因源,研究结果部分支持栽培种花生传统的植物学分类体系。为拓宽花生育成品种的遗传基础,应充分发掘ICRISAT微核心种质各基因源的遗传潜力。

超声提取正相高效液相色谱法测定大豆及大豆油中的磷酸甘油酯

建立了超声提取-固相萃取纯化/正相高效液相色谱测定大豆及大豆油中磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)的方法。考察了提取溶剂、超声功率、超声时间、提取温度及净化方式的影响,并研究了不同色谱固定相对磷酸甘油酯分离效果的影响。优化的实验条件为:以氯仿-甲醇(2∶1,体积比)为提取溶剂,1 500 W功率超声提取30 min;氨基固相萃取柱为纯化小柱;正己烷-异丙醇-1%HAc(8∶8∶1,体积比)为流动相。在该条件下,PC、PE、PI的线性范围分别为0.08～8.00、0.15～15.00、0.30～20.00 g.L-1,定量下限分别为0.021、0.050、0.060 g.L-1,检出限在8～23 mg.L-1之间,其在大豆和大豆油中的回收率为85%～108%。日内与日间精密度分别不大于4.7%和8.6%。

水培条件下花生对缺铁的生理反应

通过对5份花生(中国3份和印度2份)种质资源在水培缺铁条件下各种生理性状的研究,明确花生耐铁的生理或农艺指标,为花生耐缺铁种质资源的筛选和利用提供理论和实践依据。结果表明,缺铁明显影响品种(中花5号、远杂9102和ICG 11855)的生物产量;7d内中花8号、远杂9102和ICG 12672培养液的pH值下降3个单位,而中花5号和ICG11855仅下降2个单位。缺铁处理25d后,中花5号、远杂9102和ICG 11855幼叶的叶绿素含量、SOD、POD和CAT活性下降非常明显,而中花8号和ICG 12672幼叶的叶绿素含量、SOD、POD和CAT活性基本维持不变,这说明缺铁对中花8号和ICG 12672的叶绿素含量降低和细胞膜伤害较小。从膜氧化产物MDA的变化值也印证了缺铁对中花8号和ICG 12672的细胞膜伤害较小。综上所述,认为中花8号和ICG 12672对缺铁不敏感,而中花5号、远杂9102和ICG 11855对铁敏感,同时表明利用水培技术研究花生耐铁是一种简单有效的方法。根据相关分析,选择缺铁处理25 d后的叶绿素含量作为耐缺铁筛选的指标。

ICRISAT花生微核心种质青枯病抗性鉴定

通过对ICRISAT花生微核心种质155份材料青枯病的抗性鉴定,研究利用核心种质发掘抗青枯病材料的有效性,并研究抗病种质的遗传多样性。通过抗青枯病鉴定,获得ICG9249和ICG12625两份抗青枯病材料,其平均抗性达到了91.7%。与中国核心高抗5份种质共同作为材料,以SSR技术对其亲缘关系和遗传多样性进行了分析。在选用的58对SSR引物中,24对引物能扩增出稳定的多态性条带,这些引物能在抗青枯病花生种质基因组DNA中扩增出2~7个DNA片段。结果表明,7份抗青枯病种质的遗传距离为0.17~0.71,平均为0.49。其中ICG12625和撮豆、富川大花生的遗传距离最大（0.71）,嵊县小红毛和富川大花生的遗传距离最小（0.17）。经过统计,两两品种之间遗传距离达0.50以上的有12个组合,说明了这些抗青枯病种质资源的遗传多样性。根据DNA扩增结果,绘制了抗青枯病种质的指纹图谱,明确了其SSR分子特性。通过聚类分析结果和植物学性状调查结果显示,两份ICRISAT微核心种质材料与中国核心种质距离较远,且具有优良的植物学性状。因此,ICRISAT微核心种质青枯病抗性材料的发掘对扩宽中国花生青枯病抗性育种的遗传基础极有很高的理论应用价值,为花生抗青枯病材料的应用奠定了基础。

青枯菌诱导的花生基因表达谱SSH分析

以抗青枯病花生种质‘J4’和‘中花6号’、感青枯病花生品种‘中花12号’为材料,用强产青枯菌毒菌株(Ralstonia solanacearum)对其根系分别接种,采用抑制差减杂交(SSH)技术检测花生根系应答侵染的基因表达谱变化,并对文库中差异基因进行Real-time PCR分析。结果表明:经菌液PCR检测对挑选出的1 036阳性克隆片段进行测序及片段整合分析,获得162条花生基因,有功能注释的基因58条,其中44条基因参与了细胞结构(6%)、信号转导(12%)、抗病防御(5%)、转录调控(12%)等生理过程。用Real-time PCR技术对7个基因在‘中花6号’和‘中花12号’中的表达模式分析结果表明,6个基因在青枯菌侵染早期在抗病材料‘中花6号’中呈上调表达,可能与青枯病抗性直接相关。

白菜和甘蓝基因组转座子表达及其对基因调控的潜在影响

转座子或转座元件是大多数真核生物基因组的主要组成成分。甘蓝(Brassica oleracea)基因组比白菜(B.rapa)大主要是转座子的扩增差异造成的。然而,这两个芸薹属近缘物种转座子表达水平以及对基因的调控和功能的影响目前还不清楚。文章对白菜和甘蓝叶、根、茎3个器官的转录组数据进行了初步分析。结果显示,转座子的表达量很低,转录组reads中有1%来自转座子的转录本;转座子的表达存在器官差异,且不同类别和家族的转座子表达量相差很大,相同类别和同一家族的转座子在白菜和甘蓝基因组中的表达活性也不相同。进一步鉴定到转录读出的LTR反转座子,其与下游基因距离小于2 kb的有41个,小于100 bp的有9个,这些LTR的转录读出很可能通过正义或反义的转录本激活或干扰下游基因的表达。同时,具有转录读出的intact LTR比solo LTR具有更强的读出活性。通过深入分析转座子的插入位点发现,白菜基因组中转座子插入基因内部的频率比甘蓝基因组中的高;与反转座子相比,DNA转座子更偏向于插入或保留在基因的内含子当中。这些结果为认识转座子对其他蛋白编码基因的影响提供了基础。

Ac/Ds系统及其在油菜突变体库构建中的应用策略

随着油菜基因组测序工作的完成和后续完善,油菜功能基因组学必将成为研究热点,如何构建高通量的突变体库则是影响其进展的关键。Ac/Ds(Activator/Dissociation)系统是构建插入型突变体库的理想技术,在水稻(Oryza Sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等异源植物中应用较广,但在油菜中尚处于起步阶段。文章介绍了Ac/Ds系统的结构特点、转座机理等基本概况,阐述了利用Ac/Ds系统构建植物突变体库的优势及存在的问题。结合模式植物水稻和拟南芥的研究成果,进一步分析了利用Ac/Ds系统构建油菜突变体库的改进策略,并对其在油菜功能基因组研究中的应用前景进行了展望。

风味蛋白酶水解菜籽蛋白中2S和12S条件的优化

通过单因素试验和正交试验,研究了风味蛋白酶对菜籽蛋白中2S(RP-2S)和12S(RP-12S)的水解条件。结果表明,水解RP-2S的最佳酶解条件为底物浓度1%,酶与底物浓度比(E/S)95LAPU/g,酶解温度50℃,pH 7.0,酶解时间3 h,此条件下RP-2S的水解度达33.64%;水解RP-12S的最佳酶解条件为底物浓度1%,酶与底物浓度比(E/S)85 LAPU/g,酶解温度50℃,pH 6.6,酶解时间3 h,此条件下RP-12S的水解度达19.97%。

甘蓝型油菜BnERF50的超表达增强了转基因拟南芥对核盘菌的抗性

从接种核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)后的甘蓝型油菜品种中双9号cDNA芯片中筛选出一个新的抗性相关基因BnERF50。序列分析表明该基因产物BnERF50蛋白含有一个典型的ERF(乙烯相应转录因子)保守结构域,属于ERF家族成员。接种核盘菌24h后,该基因的表达量被诱导显著上调。在它的超表达转基因拟南芥中,病原相关蛋白(PR)防御素基因PDF1.2和几丁质酶基因ChiB的表达量升高,对腐生营养型真菌核盘菌的抗性显著增强。

高等植物基因克隆的策略

基因克隆是进行植物基因功能研究的先决条件。随着拟南芥、水稻、杨树等植物全基因组序列的公布,标志着基因组进入后基因组研究时代是分子生物学发展的必然趋势,同时为进一步克隆植物中控制重要性状的主效基因提供强大的基因组数据支撑。目前有较多的基因克隆传统及衍生技术,文章综述了图位克隆、同源克隆、转座子标记法、表达序列标签法、差异表达基因克隆等5种应用比较广泛的基因克隆技术,并就其发展方向和策略作了展望。

甘蓝型油菜ADC基因片段的克隆及序列分析

【目的】克隆甘蓝型油菜精氨酸脱羧酶(ADC)基因的cDNA片段,为进一步获得ADC基因全长及研究其的生物学功能奠定基础。【方法】以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种中双6号的花蕾为材料,设计简并引物,采用同源克隆法扩增ADC基因的cDNA片段。【结果】成功扩增获得8个不同的ADC基因拷贝,按长度将其分为1011、999、981bp3类,8个拷贝核苷酸序列之间的同源性为81%～99%,其推导氨基酸序列之间的同源性为86%～99%。1011bp片段包含3种不同的序列S1～S3,序列间存在9个单核苷酸多态性(SNP)位点。999bp序列包含S4和S5,具有3个SNP位点,两个区段出现连续碱基缺失。981bp序列包含S6～S8,发现14个SNP位点,且第67位核苷酸出现无义突变,4个区段发生碱基缺失。序列S4～S8共同缺失第632～634、642～650位的核苷酸小片段。氨基酸同源比对和系统进化分析结果表明,8个不同ADC基因拷贝与芥菜(Brassica juncea L.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、盐芥(Thellungiella halophila L.)等物种的ADC基因同源性高,亲缘关系近。【结论】所获得的8个基因拷贝即为来自于甘蓝型油菜ADC基因的片段。

异源表达脂肪酶的重组酵母筛选培养基的改良

在脂肪酶产生菌的筛选中,最常用的方法是三丁酸甘油酯琼脂平板透明圈法和橄榄油琼脂平板变色圈法。而传统的三丁酸甘油酯平板缺乏有效营养成分,重组酵母无法生长;橄榄油平板灵敏度较低,低脂肪酶活力的重组酵母不能产生变色圈,这给产脂肪酶基因工程菌的鉴定带来了困难。本研究在三丁酸甘油酯平板的基础上,添加适合酵母生长的营养成分,获得了新的改良培养基;重组酵母在该培养基上生长良好、水解圈清晰,检测脂肪酶灵敏度高。

青枯菌诱导下花生基因组DNA表观遗传变化的MSAP分析

以高感青枯病品种中花12号和高抗青枯病品种远杂9102为材料,调查青枯菌接种12 h后花生基因组DNA的甲基化水平和变化模式。甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)分析表明,正常生长的中花12号和远杂9102的基因组DNA甲基化比率均为35.1%,经青枯菌接种12 h后,中花12号降低到31.3%,而远杂9102的基因组DNA甲基化比率则升高至37.2%。与对照相比,青枯菌接种12 h胁迫下中花12号和远杂9102基因组DNA的甲基化和去甲基化分别为5.9%,12.4%,18.3%,11.9%。由此推测,高抗青枯菌的花生经青枯菌侵染后基因组DNA某些位点的甲基化状态发生变化而使基因表达发生了改变,产生或启动对青枯菌胁迫的能动应激机制。

甘蓝型油菜种子和角果皮中硫苷含量的动态变化及转录组关联分析

【目的】探索甘蓝型油菜不同发育时期种子和角果皮硫苷含量的动态变化规律,通过转录组关联分析解析控制硫苷含量变异的遗传机制。【方法】在由113个油菜品种构成的自然群体中,利用高效液相色谱法检测不同发育时期油菜种子及角果皮中的硫苷含量。提取油菜幼嫩叶片m RNA并进行m RNA-Seq测序,开发了355 536个单核苷酸多态性标记(SNP)和116 098个基因表达量标记(GEM)。将开发的SNPs和GEMs分别导入到混合线性模型(MLM)和回归分析模型中进行关联分析,获得与油菜硫苷表型变异显著相关的遗传位点,进一步通过序列比对和功能预测筛选确定候选基因。【结果】授粉后15 d(15 DAP),油菜种子和角果皮的硫苷含量变异范围分别是1.69—20.45和1.47—25.23μmol·g^(-1)。25 DAP种子、25 DAP角果皮以及成熟种子的硫苷变异范围分别是2.17—147.21、0.73—130.77和8.87—111.83μmol·g^(-1)。后两个时期(即25 DAP和成熟期)的硫苷含量表现出较大变异,适合进行转录组关联分析。基于m RNA-Seq测序数据,经质量控制后获得256 397个高质量的SNP标记(MAF>0.01)和53 889个GEM标记(平均基因表达量>0.4)。利用SNP标记对成熟种子、25 DAP种子和25 DAP角果皮硫苷含量进行关联分析,分别检测到167、158和3个显著关联位点(-log10P>6.71)。其中,与成熟种子显著关联的SNP标记形成5个明显的关联峰,分别位于A2、A9、C2、C7和C9染色体上。同时,利用GEM标记进行的关联分析中,分别检测到127、16和24个与成熟种子、25 DAP种子、25 DAP角果皮硫苷含量显著关联的位点(-log10P>6.03),这些位点主要分布在A2、A8、A9、C2和C9染色体上并形成明显的关联峰。其中,成熟种子和25 DAP角果皮在A9、C2和C9染色体上形成共同的关联峰。通过与公共数据库的基因组序列比对和功能注释,共筛选到295个功能基因,其中25个基因涉及硫苷代谢网路途径,直接参与硫苷的调控。其余基因虽然没有直接参与硫苷代谢过程,但是它们大多属于转录因子基因、刺激响应因子基因,涉及细胞过程或是具有催化活性,因而推测在硫苷积累中同样起到重要作用。【结论】油菜角果皮中的硫苷含量较高,而且与种子硫苷含量显著正相关,是硫苷合成或转运的重要器官。共检测到328个SNP显著标记和144个GEM显著标记,筛选到25个与硫苷合成或者转运有关的功能基因以及73个功能未知的新基因。