烟草细胞色素P450的基因组学分析

细胞色素P450是一类含血红素的单加氧酶超基因家族,在植物多种代谢途径中起着重要作用。为了解烟草中的P450的种类和数量,文章将植物代表性P450蛋白质序列与烟草基因组序列比对,在烟草基因组中鉴定了44个P450家族共263个成员。将这些烟草P450基因与烟草表达序列标签(EST)比对,发现173个成员有EST证据。通过与拟南芥中已知的P450蛋白序列比较,分析了部分烟草P450蛋白序列的特征和二级结构。根据烟草基因芯片数据和部分基因的RT-PCR结果,发现73个烟草P450基因能够在不同的生长发育时期表达,其中部分基因具有组织特异性。这些研究结果为烟草P450基因功能的深入分析奠定了基础。

基于关联分析发掘烟草高钾优异等位变异

采用全基因组454个SSR位点对96份烤烟种质资源进行了群体分型,获得有效等位变异1038个。NJ聚类分析将供试材料分为3个类群,群体结构分析表明,当K=3时,ΔK值最大。同时对该供试材料在4个环境进行了烟叶钾含量测定,其频率符合正态分布。采用混合线性模型(MLM),进行了标记-性状关联分析,获得11个烟草钾含量的关联标记。通过不同基因型的钾含量对比,获得5个高钾优异等位变异。为验证这些优异等位变异,本研究又利用这5个关联标记扫描了其他130份烟草种质,获得了一致的结果。表明可以利用这5个高钾等位变异对烟草种质资源进行定性筛选,促进烟草高钾种质的利用和品种选育。

烟草C2H2锌指蛋白转录因子家族成员的鉴定与表达分析

C2H2锌指蛋白转录因子家族在真核生物中具有重要的生物学功能,广泛参与植物叶的发生、花器官的调控、侧枝的形成及逆境胁迫等生命过程。植物C2H2锌指蛋白不仅结合DNA和RNA,而且与蛋白质之间相互作用。本研究利用普通烟草(Nicotiana tabacum)基因组数据库,运用Blastp比对,结合Pfam和SMART分析,鉴定了118条普通烟草C2H2锌指蛋白家族成员;对烟草C2H2锌指蛋白家族进行了进化树分析、结构域分析、物理化学性质分析、染色体定位、基因结构分析、三维结构分析及组织表达分析等。结果表明:不同成员的氨基酸长度差异较大;系统进化及结构域分析显示,所有C2H2家族成员可以被分为5个亚家族,同一亚家族成员之间在结构域和理化性质上呈现较高一致性;每个成员都含有C2H2结构域,在数量上存在较大差异;将所有基因家族成员定位在22条染色体上;组织表达分析表明,每个C2H2亚家族都有成员在不同组织中表达,在叶及根中有些基因的表达量较高。

烟草不同胞质来源雄性不育系小孢子发育的细胞学观察

为比较可育系与不育系小孢子发育过程的异同,明确两种不育类型小孢子败育的时期、方式以及发生机理,为合理利用烟草CMS种质提供细胞学资料,对烟草两种同核异质不育系MS G-28、86-6的小孢子败育过程进行了细胞学比较观察,并用其保持系G-28作对照。结果发现:与保持系G-28的小孢子发育特点及发育过程相比,不育系MS G-28败育特点为绒毡层异常增生,绒毡层与小孢子粘连、小孢子粘连、解体等,败育阶段以小孢子母细胞时期、四分体以及单核小孢子时期为主;不育系86-6败育特点为无孢原细胞分化、无造孢细胞分化,绒毡层肥大、液泡化、延迟解体以及小孢子粘连、空壳小孢子等,败育阶段主要在造孢细胞分化之前、小孢子母细胞时期。G-28花粉外形饱满,圆形,生活力强;而两种不育系花粉外形不规则、空瘪,无生活力。得出结论:绒毡层异常是两种类型不育系败育的主要原因,但MS G-28败育高峰主要在小孢子发育的后期,而86-6败育高峰主要在小孢子发育的前期。

四种细胞质来源的烟草不育系线粒体SSR位点差异

采用线粒体SSR(mtSSR)方法对普通烟草4种不育类型的不育系、不育胞质来源的烟草野生种和保持系进行线粒体位点差异分析,探讨mtSSR位点差异与胞质不育的关系。在烟草线粒体基因组上检索到24个能重复稳定扩增出片段的mtSSR,对烟草属植物的这些mtSSR分析结果显示,普通烟草种内mtSSR较为保守,多态性比率仅10.5%;4种不育类型的各自不育系与保持系、不育胞质上存在多个差异位点,在Nta(sua.)S类型中差异位点在线粒体编码基因orf138a、orf138c以及orf102～orf210的基因间区;在Nat(gla.)S类型中,差异位点在线粒体orf138a、orf138c两个编码基因以及nad2～sdh3、rps12～orf125b、orf116～orf101b、orf102～orf210的4个基因间区;在Nta(rep.)S类型中,差异位点在线粒体编码基因orf190以及orf104c～orf202的基因间区;在Nta(rus.)S类型中,差异位点在线粒体编码基因orf137以及rps12～orf125b的基因间区。这些位点差异可能与各自的雄性不育有关。另外,mtSSR引物TMS20在Nat(sua.)S、Nat(gla.)S、Nat(rep.)S和Nat(rus.)S类型的雄性不育系中分别扩增出了184、172、212和225bp的片段,表明可用该引物区分4种烟草CMS类型。

烟草抗马铃薯Y病毒病相关基因NtPsaN的克隆及表达分析

【目的】从高抗PVY烟草品种VAM中克隆抗病相关基因,分析该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在烟草抗PVY防御反应中的作用,为培育抗PVY烟草新品种奠定基础。【方法】利用SSH结合cDNA芯片筛选出来的病害诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆烟草抗病相关基因;生物信息学分析该基因保守结构域以及序列特征;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用实时荧光定量RT-PCR技术研究该基因的表达特性。【结果】克隆了1个烟草抗病相关基因,命名为NtPsaN,该基因具有PsaN基因家族保守结构域,OFR长度507bp,编码168个氨基酸;构建了PsaN亚基系统进化树;实时荧光定量RT-PCR结果显示接毒之后该基因表达与不接毒对照相比有明显上调趋势。【结论】克隆得到一个烟草PVY抗病相关基因NtPsaN,其表达受PVY侵染诱导,该基因可能在烟草抵御PVY病害侵染过程中起重要作用。

绒毛状烟草钙依赖蛋白激酶基因家族分析

钙依赖蛋白激酶(CDPK)是一个多基因家族,在植物的钙信号转导中具有重要作用。以拟南芥、普通烟草和烟草属其他种中已知的CDPK序列检索绒毛状烟草基因组框架图数据库,获得绒毛状烟草CDPK基因,并对其进行基因结构、GC含量、系统进化关系、主坐标和基因表达谱分析。结果表明:共分离获得25个绒毛状烟草CDPK基因,它们均具有完整的开放读码框;系统进化树和主坐标分析证实这25个CDPK分布于4个亚家族中;RT-PCR分析显示,绒毛状烟草CDPK基因家族的空间表达存在明显的差异性。此为进一步阐明CDPK基因家族在烟草的钙信号转导过程中的功能及分子机制奠定了重要基础。

普通烟草MATE基因家族分析及功能预测

植物多药和有毒化合物排出家族(MATE,multidrug and toxic compound extrusion)是一类可转运毒素、金属离子、次级代谢产物的次级转运蛋白家族。该家族主要在植物的解毒机制中发挥作用,部分成员也参与植物的形态建成过程。MATE家族在烟草基因组中的数量、特征及功能目前尚未开展系统分析。本研究利用生物信息学方法对普通烟草(Nicotiana tabacum)基因组中的MATE基因进行了预测分析,共预测到131个基因,分为4个亚家族。亚家族3在进化树中形成较为独立的分枝,其跨膜区数量、亚细胞定位、保守结构域方面与其他亚家族不同。转录组数据显示,相当一部分MATE家族基因在所有组织中低量表达。GO功能注释结果表明该家族成员主要作为一种转运体,在应激响应、生物调控等过程中发挥作用。本研究为烟草及其他植物中MATE家族的鉴定和功能研究提供了数据基础。

普通烟草CESA基因家族成员的鉴定、亚细胞定位及表达分析

纤维素合成酶蛋白(cellulose-synthase proteins,CESA)是一类质膜定位蛋白,以蛋白复合体的形式存在于质膜上合成纤维素,在细胞壁建成和植物生长发育过程中起着非常重要的作用。本研究利用CESA蛋白保守域序列PF03552检索普通烟草(Nicotiana tabacum L.)蛋白序列,并通过拟南芥(Arabidopsis thaliana)10个CESA蛋白序列在普通烟草基因组数据库中利用TBLASTN程序进行比对,共获得21条NtCESA基因候选序列,对这些序列进行蛋白序列理化性质分析、系统进化树构建、基因结构分析、保守结构域及跨膜区分析和组织表达模式分析,并对NtCESA9和NtCESA14两个蛋白进行了亚细胞定位实验。结果表明:获得的21条NtCESA蛋白序列的理化性质相似;系统进化分析将21个NtCESA基因和10个At CESA基因分成5个分支,每一个分支各成员之间的进化相对保守,基因结构类似,不同分支之间的基因结构差异也较小;NtCESA蛋白结构域相对保守,都含有CESA蛋白典型的N端锌指结构、C端跨膜区和DDD-QXXRW保守功能域;组织表达分析结果表明,大部分NtCESA基因在幼苗和成熟期烟草的根、叶、胚芽和愈伤组织中都有表达,同一个分支中的基因表达模式基本一致,并且NtCESA基因参与初/次生细胞壁纤维素的合成与该基因编码蛋白的跨膜区数目存在关联,表明NtCESA基因家族成员功能上的复杂性;亚细胞定位结果证实NtCESA9和NtCESA14为质膜定位蛋白。本研究为烟草CESA基因家族功能的深入研究奠定了基础。

烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建烟草叶片全长cDNA文库并测序,发掘与烟叶发育、代谢和抗逆相关的基因,为进一步研究功能基因奠定基础。【方法】以烟草苗期叶片为试验材料,利用改进的Cap-trapper法构建烟草叶片全长cDNA文库。利用测序技术获得大量的EST序列,采用生物信息分析手段,对所测EST进行拼接和功能注释。【结果】构建了烟草叶片的全长cDNA文库,该文库滴度为1.2×106pfu.mL-1,平均插入片段在1.4 kb左右。利用该文库测序了5 280个克隆,获得5 233条高质量表达序列标签(EST),序列拼接出3 922个单一基因;同源比对分析表明,89.7%的基因与已知功能基因具有较高的同源性,这些基因涉及细胞生长、信号转导、翻译合成、抗逆反应和能量代谢等功能;并详细鉴定了部分与烟碱合成和抗病相关的基因。【结论】通过Cap-trapper法成功构建了高质量的烟草幼苗叶片全长cDNA文库;大规模EST测序分析挖掘到大量与烟草幼苗叶片发育、抗逆、抗病、烟碱代谢相关的侯选基因。

烟草碱法提取基因组DNA的改进

为能够快速高效的对大量转基因烟草样品进行DNA提取,对碱法提取烟草组织DNA的方法进行了改进。采用0.01mol/L的Na OH溶液为提取液,破碎转基因烟草叶片组织后无需经过加热煮沸中和等步骤,上清液可直接用作PCR反应的模板。结果表明,0.01-0.1 mol/L之间的Na OH溶液制备的DNA模板均能成功扩增,该方法制备的DNA模板不依赖特殊的反应条件,多种品牌的PCR Mix均能成功进行扩增反应。与传统SDS提取法和试剂盒提取法获得的DNA相比,PCR结果没有明显差异。此提取方法在小麦、高粱、水稻、玉米等作物上也取得了很好的实验效果。通过本方法制备的DNA模板,其PCR扩增的产物可直接用来测序分析。该方法使用仪器少,样品消耗少,快速、简便、成本低,没有交叉污染,能够在短时间内处理大量样品,因此能够对大量的转基因烟草样品进行DNA的快速提取和鉴定。

烟草T-DNA插入位点侧翼序列扩增方法的筛选与优化

烟草T-DNA激活标签插入突变体库的创制过程中,需要进行大量的T-DNA插入位点的侧翼序列扩增,因此选择一种适用于烟草T-DNA侧翼序列扩增的高效方法尤为必要。本研究比较了TAIL-PCR、PCR-walking、FPNI-PCR三种方法对T-DNA插入位点侧翼序列的扩增效率、插入位点确定的比例和同源蛋白比对结果,并对3种方法的PCR程序、体系和引物设计等方面进行了优化,确定TAIL-PCR更适合烟草的侧翼序列扩增,通过产率、条带长度、插入位点和同源蛋白比对结果的比较,得出TAIL-PCR更适合烟草的侧翼序列扩增。这一结果为应用烟草突变体开展烟草基因功能的研究奠定了基础。

普通烟草PMEI家族的鉴定与表达分析

果胶是细胞壁的重要组成部分,它不仅在细胞之间的连接上起着关键作用,还能维持细胞壁结构稳定和抵御病原的侵害。细胞壁中的果胶甲酯酶抑制剂(pectin methyl ester enzyme inhibitor,简称PMEI)可以调控果胶甲酯酶(pectin methyl ester enzyme,简称PME)对果胶的去甲酯化作用,从而引起细胞壁结构和功能特性的改变。为深入研究PMEI基因家族在烟草生长发育过程中的功能,采用生物信息学方法,在普通烟草基因组中共鉴定出90个PMEI基因家族成员,并对其进行基因结构、系统进化树、蛋白理化性质、保守结构域、表达分析和基因本体(gene ontology,简称GO)分析。结果表明,烟草PMEI基因家族可以分为5个亚家族,在进化树中形成明显不同的分支,同一亚家族中各成员的基因结构、编码蛋白的理化性质及保守域呈现较高的一致性。每个成员都含有由4个反向平行α螺旋组成的PMEI结构域,结构域序列中有4个极为保守的半胱氨酸残基,形成2个二硫键。GO分析结果显示,所有烟草的PMEI蛋白都具有酶抑制活性,大部分成员参与细胞壁的修饰过程。PMEI成员在烟草不同组织中均有表达,其中在茎、叶脉、幼苗叶和幼苗根中的基因表达数较多;第Ⅳ、Ⅴ亚家族成员在幼根、幼叶中表达量较高。研究结果将为烟草PMEI家族的深入研究提供依据,为进一步解析PMEI基因的功能奠定基础。

雪茄烟新品种雪雅香1号的选育及特征特性

【目的】选育适合国内种植的优质抗病雪茄烟茄衣新品种。【方法】以优质雪茄烟品种M6的雄性不育系(MSM6)为母本,抗病性强且产量较高的J20为父本,杂交选育了雄性不育一代杂交种雪雅香1号。【结果】该品种田间生长势强,生长整齐一致;抗病性表现较好,对烟草普通花叶病毒病(Tobacco mosaic virus, TMV)免疫,中抗黑胫病,中抗~抗青枯病,抗根黑腐病;烟叶主要经济性状表现较好,化学成分比例较协调,外观质量、物理特性符合优质茄衣的要求;雪茄烟风格较显著,香气量和香气质的表现较好。【结论】雪雅香1号是我国自主选育的雪茄烟新品种,能够兼顾品质、经济和抗病性,烟叶质量可以满足中式茄衣的需求,适宜在四川烟区、湖北烟区及国内其他同类烟区种植。

雪茄烟新品种川雪5号的选育及特征特性

雪茄烟新品种川雪5号是以优质、高产、多抗为育种目标,以J20为母本,Ha20为父本,经系谱法选育而成的纯系品种,2023年通过全国烟草品种审定委员会审定。川雪5号生长势强,株型筒形,叶形宽椭圆,主要农艺性状和经济性状优于对照品种H382;对TMV免疫,抗CMV,中抗黑胫病和青枯病,中感PVY;川雪5号烟叶组织细腻,物理特性略优于H382,主要化学成分含量比例较协调;四川中烟、安徽中烟及浙江中烟对川雪5号进行工业评价,均认为其雪茄风格明显,在香气特征和口感指标上表现较好,是较好的茄衣品种。综合评价,川雪5号是质量性状、经济性状和抗病性状较能兼顾的雪茄烟新品种,适宜在四川、山东、安徽等烟区种植。

烟草PMT基因单核苷酸多态性与烟碱含量变异的研究

为了解析不同烟草品种间烟碱含量差异的遗传机制,深入探索烟碱表型变异与基因序列多样性之间的关系。本研究从29份烤烟品种全基因组重测序所揭示的基因组序列变异中,分析了普通烟草种4个PMT基因家族基因的SNP和Indel变异,筛选错义突变位点。发现在NtPMT2基因第1个外显子的第75个碱基处存在1个错义SNP位点C23_49502707,在供试群体存在G和T两种等位变异。结合8个环境点的烟碱表型鉴定,可知在显著水平上T基因型等位变异供试品种的烟碱平均含量比G基因型的高14.7%,是高烟碱优异等位变异。进而对该位点进行了PCR标记转化,并筛选到1对扩增稳定、带型清晰的功能标记。本研究为克隆烟碱含量调控相关基因奠定了良好的实验基础,为高烟碱品种的分子标记辅助选择提供了可用的标记和基因资源。

烟草航天诱变突变体叶形遗传分析及基因定位

利用航天诱变方法获得烟草品种NC89的突变体NC89-M,与野生型相比,NC89-M叶形呈宽椭圆,叶面褶皱,叶缘呈锯齿状。为明确烟草航天诱变突变体NC89-M叶形突变机理,挖掘突变体叶形突变基因,利用NC89-M与烟草品系2014-168杂交获得F2群体,对F2群体遗传分析表明突变体叶形性状受1对显性主效基因控制。通过混合集团分离法,确定SSR标记PT60795与叶形性状连锁。利用已有的突变体基因组序列信息,开发InDel标记最终将突变基因nc89m定位于标记PT60795与InDel5之间,遗传距离分别为2.9 cM和4.4 cM。在该区间内发现在叶片中高表达的基因Nitab4.5_0000008g0880.1编码区第1 294个核苷酸发生突变,由腺嘌呤突变为胞嘧啶,其编码氨基酸由酪氨酸突变为天冬氨酸,因此将其作为nc89m的候选基因。本研究为Nitab4.5_0000008g0880.1的基因克隆及功能验证打下基础。

烤烟主要农艺性状变异特征以及与烟碱含量的相关分析

为加快高烟碱烤烟品种的田间选育,以116份烤烟种质资源为供试材料,连续种植4年,于烟叶成熟期测定其13个农艺性状,采用因子分析、逐步回归分析、二次响应面分析等方法探讨了烤烟烟碱含量与农艺性状之间的相关性。结果表明,烤烟主要农艺性状变异丰富,变异系数达5.64%~16.96%。烟碱含量变异系数达到24.3%。简单相关分析表明,烟碱含量与节距呈极显著正相关,与茎围、叶数呈显著负相关。通过因子分析,明确了与烟碱含量相关的主要农艺性状包括烟叶长宽比因子、叶数因子、叶长因子、株高因子。采用逐步回归分析法,建立了烤烟主要农艺性状与烟碱含量之间的回归模型,经统计学检验,达到极显著水平。通过二次响应面分析,展现了腰叶长、下二棚叶长与烟碱含量之间的动态变化关系,当下二棚叶长63.7 cm,腰叶长58.7 cm,烟株的烟碱含量稳定且有极小值。烟叶长宽比较小、节距较大、叶数较少和株高较高的烤烟,烟碱含量较高,因此,在选育不同烟碱含量的烤烟品种时,应综合考虑。

烤烟烟碱含量的全基因组关联分析

烟碱是烟草属特有的一类生物碱,为加深对烟碱遗传调控机制的解析,充分挖掘高烟碱优异等位。本研究选取219份烤烟品种开展了RAD重测序研究,获得了384,904个高质量SNP位点的群体分型数据。同时在四川西昌和山东诸城2个试验点,于2012—2015年相同栽培管理条件下对供试品种的烟叶烟碱含量进行了表型鉴定。利用全基因组关联分析的策略,共发掘到2个与烟碱含量显著关联的SNP位点,分别位于1号染色体的69,912,063bp处和2号染色体的81,115,794bp处。基于上述SNP位点预测到2个候选基因,并将目标SNP位点转化3对可通过PCR检测的功能标记。通过以上研究,加深了烟碱遗传调控机制的解析,为高烟碱优异等位基因型的发掘和高烟碱新品种的分子标记辅助选择提供了可用的标记和基因资源。

一种从非变性聚丙烯凝胶中回收小片段DNA的方法

利用高分辨率的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、纯化特异性小片段DNA的首选方法,也是开展后续多种分子生物学试验的前提。本试验比较了改良煮沸法(液氮研磨+煮沸+低温浓缩)、煮沸法及直取法回收小片段DNA,以回收样品模板进行第二次PCR扩增,结果表明:改良方法回收的DNA的纯度高,特异性好,回收率与经典煮沸法相当。在保证回收产物的特异性时,用低温浓缩法替代乙醇/醋酸钠共沉淀也具有可行性及一定的创新性。