犬细小病毒病实验室诊断方法研究进展!

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一种急性、烈性传染病。通过分析犬细小病毒病现有的诊断手段,对犬细小病毒病的预防和控制具有重大意义。目前常用的犬细小病毒病监测指标主要包括CPV、CPV DNA、CPV抗原、抗-CPV抗体。核酸监测由于快速,方便操作、灵敏的特点,被认为是实验室常用诊断手段,也是"金标准",对发病或隐性带毒犬都有特别的优势。CPV抗原作为现症感染指标、抗-CPV抗体作为现症感染和既往感染的指标,基于此建立的ELISA、胶体金试纸条大大节约了检测时间。文中将从犬细小病毒免疫原诊断以及分子生物学诊断两方面将其实验室诊断方法的研究进展进行综述。

原细小病毒属病毒感染及其抗肿瘤机制研究进展

原细小病毒(Protoparvovirus,PtPV)是一类感染多种动物或人类并引起广泛的病理反应的病毒。在PtPV感染过程中,其衣壳蛋白和非结构蛋白发挥了重要作用。衣壳蛋白通过与宿主细胞膜上的受体相互作用,促使PtPV进入宿主细胞。非结构蛋白则在宿主细胞内复制时发挥作用。PtPV的非结构蛋白NS1是一种关键蛋白,它不仅在病毒复制中发挥作用,还具有嗜瘤性和溶瘤性。研究表明,NS1蛋白可以抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡,这使得异位表达NS1蛋白成为潜在的抗肿瘤策略。PtPV的衣壳蛋白也具有广泛的应用前景,衣壳蛋白可作为载体,在基因疗法和药物递送应用中发挥重要作用:衣壳蛋白组装为病毒颗粒,装载外源基因或药物,并通过PtPV的感染途径将其输送到宿主细胞中。这种基于病毒的基因或药物递送系统已被广泛研究,并在临床治疗中应用。虽然已了解PtPV感染的关键因素和效应,但其分子机制尚不完全清楚。研究表明,PtPV可能涉及多个信号通路的调节和活化,包括炎症反应、DNA损伤应答和细胞凋亡等。尽管PtPV可能引起多种疾病,但随着研究的深入,目前已有相关药物和疫苗可用于预防或治疗PtPV感染,而其衣壳蛋白和非结构蛋白在生物技术和医学领域具有重要的应用前景。关于PtPV的进一步研究和深入理解会促使其应用于新的领域,并更好地应对与其感染及相关疾病相关的挑战。

猪源牛病毒性腹泻病毒JLS-01株的分离鉴定及致病性研究

为了解猪源牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的分子特征及致病性,本研究利用RT-PCR从吉林省某猪场出现严重腹泻症状的仔猪病料中检测到BVDV核酸阳性,将处理后的BVDV阳性样品接种于MDBK细胞,分离到1株病毒,命名为BVDV JLS-01。通过免疫荧光检测、5′UTR与Npro RT-PCR扩增对其分子进化特征进行分析。结果显示,该分离毒株在MDBK细胞上盲传至8代未出现细胞病变,在免疫荧光试验中呈阳性荧光信号。RT-PCR扩增获得大小分别为280和735bp的5′UTR和Npro片段。BVDV JLS-01株5′UTR与Npro序列遗传进化分析表明,其与LN-1和ZM-95亲缘性最近,与牛源毒株LN-1基因同源性达99.3%,提示该毒株可能来源于牛源毒株。将BVDV JLS-01株F8代细胞培养液人工感染BVDV和猪瘟病毒(CSFV)抗体阴性猪,感染猪未表现出明显的体温升高,但白细胞数量下降,并在感染猪的白细胞提取物中分离到该毒株,表明该毒株具有一定的致病性。该毒株的成功分离对进一步开展BVDV流行病学调查及致病机理等方面的研究具有重要意义。

干扰素刺激基因15抗病毒免疫研究进展

干扰素刺激基因15(ISG15)蛋白是由干扰素或病原体刺激产生的泛素样蛋白。ISG15能够通过酶促级联反应与靶蛋白共价结合形成ISGylation,称为ISG化。ISG15在干扰素诱导的抗病毒免疫应答过程中发挥重要作用。研究发现,ISG15对多种病毒均具有抗病毒活性。此外,ISG15在细胞自噬、宿主损伤、DNA修复、蛋白翻译等过程中也具有重要作用。论文通过对近年来国内外学者在ISG15类泛素修饰系统、抗病毒免疫分子机制以及ISG15单体生物学功能等方面取得的研究进展进行综述,以期为ISG15抗病毒免疫研究和抗病毒药物的研制提供参考。

数字PCR技术研究进展

数字PCR是一种核酸定量分析的新兴技术手段,是将含有核酸模板的PCR反应分配到大量的反应单元中进行核酸扩增,反应完成后,利用可检测荧光进行统计学计数,从而定量分析样本中核酸浓度的一种方法。数字PCR不需要建立标准曲线,具有良好的应用前景。本文对数字PCR的原理、分类、检测方法、风险与优势、应用前景进行了综述。

干扰素-ε研究进展

干扰素-ε(IFN-ε)是新发现的一种Ⅰ型干扰素(IFNs),是由多种细胞分泌的一类细胞因子,其本质是一种糖蛋白,可间接发挥抗病毒、免疫调节和抗肿瘤的生物学活性。但与其他Ⅰ型干扰素不同,IFN-ε的产生不需要病毒诱导,其由黏膜上皮细胞组成型表达,并受激素调节,在黏膜免疫中具有重要作用。目前相关研究报道较少,本文就人和不同动物IFN-ε的起源、体内分布规律,以及对生殖系统的保护、神经系统的调节及抗病毒等研究进展进行综述,以便进一步了解和开发新型干扰素。

水貂沙门氏菌的分离鉴定及药物敏感性分析

为指导临床合理用药并为治疗患病水貂提供依据,本试验对山东省某水貂养殖场送检的7只疑似患有沙门氏菌病的病死水貂的肝脏和脾脏样品进行细菌分离鉴定及药物敏感性分析,通过分离纯化方法从样品中分离菌株,并采用革兰氏染色、生化鉴定和PCR方法对分离菌株进行鉴定。运用K-B药敏法检测菌株对临床常用药物的敏感性,并通过PCR方法检测菌株耐药基因及Ⅰ类整合子的携带情况。结果显示,本试验分离得到的7株菌均为革兰氏阴性、短小的杆菌;生化反应检测显示,分离菌株葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、MR试验、枸橼酸盐、硫化氢试验均表现为阳性,初步鉴定分离菌株为沙门氏菌;PCR产物测序结果进一步表明7株分离菌均为沙门氏菌;药敏试验结果显示,7株沙门氏菌对头孢曲松、左氧氟沙星、氟苯尼考和多黏菌素较敏感,对氨基糖苷类药物、四环素和氨苄西林表现为耐药;耐药基因检测结果显示,7株沙门氏菌共检测出8种耐药基因blaTEM-1、blaCTX-M-1G、aadA1、aac(3′)-Ⅳ、aac(3′)-Ⅱc、aph(4′)-Ⅰa、aph(3′)-Ⅶ和oqxAB,以及基因盒为aadA1、arr-3-aacA4和blaPSE-1的Ⅰ类整合子。综上可知,本试验在送检的7只患病水貂的肝脏和脾脏样品中分离到7株沙门氏菌,分离菌株均为耐药菌株,且主要表现为多重耐药现象;耐药基因呈多样性,且存在位于质粒上的耐药基因扩大了耐药基因的传播范围,增加了细菌的耐药性,为临床用药治疗带来困难。

犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析

为了研究当前犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)国内流行株的遗传变异情况,试验从北京某宠物基地采集疑似CPV感染死亡犬的肠道组织,无菌处理病料后,用F81细胞进行病毒培养,通过电镜形态学观察、血清学、分子生物学和攻毒试验进行鉴定。结果表明,病毒在F81细胞上出现明显的细胞病变(CPE),电镜观察可见直径20nm左右的病毒粒子,血凝效价1∶256,PCR鉴定在570bp处有特异性条带,证明分离出1株CPV,命名为CPV-BJ03/17。全基因组测序分析表明,病毒基因组全长4 620bp,提交GenBank,登录号为:MF134808;该毒株与广东(SC02/2011)、深圳(CPV-s5)和甘肃(CPV-LZ1)等地的分离株亲缘关系较近,核苷酸同源性均为99.7%。VP2氨基酸序列分析表明,CPV-BJ03/17分离株确定为New CPV-2a亚型,主要氨基酸位点与近期分离株BJ15-1等相比无明显变化。动物回归试验表明,CPV-BJ03/17为CPV强毒株。本研究分离出1株CPV强毒株,通过比较CPV的流行情况和遗传变异规律,为CPV的疾病治疗及疫苗研究提供参考。

貉源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及药敏试验

为确定河北昌黎地区某养殖场貉呼吸道疾病引起死亡的病因,本研究从送检的貉病料肺脏中分离到1株革兰氏阴性短杆菌,并对分离株进行形态学观察、16S rRNA序列测序及全自动细菌生化鉴定仪鉴定,在此基础上完成了分离株的分型、人工感染小鼠试验及药敏试验等。结果显示,该分离株为非K1/K2型肺炎克雷伯菌,并将其命名为CLKp18;该分离株的16S rRNA基因序列与GenBank中登录的多株肺炎克雷伯菌参考株同源性均高达99%。Vitek全自动细菌鉴定仪结果表明,该菌株与肺炎克雷伯菌鉴定标准相似度为99%。人工感染小鼠试验结果显示,试验组小鼠在攻毒后6 h开始出现临床症状。无菌取出死亡小鼠的肺脏、肝脏、脾脏及肾脏,划线涂板,均可分离到该菌,表明该分离株感染小鼠后,能侵入到小鼠体内多个组织器官,引起不同程度的病变,尤以肝脏和肺脏病变较为明显,对小鼠的半数致死量(LD_(50))为2.17×10~7 CFU。药敏试验结果表明,该菌对单环内酰胺类、氯霉素类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类及大部分头孢类耐药,但对阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶和亚胺培南敏感。本研究结果确定了引起本次貉呼吸道症状疾病的致病菌为非K1/K2型肺炎克雷伯菌,且该分离株有较强的致病性和多重耐药性。本研究为临床治疗由该菌引起的貉肺炎提供了参考依据。

牛副流感3型病毒Nano-PCR、LAMP方法的建立及初步应用

试验旨在建立牛副流感3型病毒(bovine parainfluenza type-3 virus,BPIV3)纳米PCR(Nano-PCR)与环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)新型快速分子检测技术,对其进行特异性和敏感性对比试验,并对10份临床样品进行了检测。特异性与敏感性试验结果显示,建立的Nano-PCR和LAMP方法只对BPIV3特异,而对牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒无交叉反应;建立的Nano-PCR和LAMP方法具有相同的敏感性,均是普通PCR的10倍,最低核酸检出量均为4.16×102拷贝/μL。临床检测结果显示,建立的两种方法阳性符合率为100%,且阳性检出率均高于普通PCR。因此,本试验建立的Nano-PCR和LAMP方法为BPIV3的临床诊断提供了更快速、敏感、可靠的工具。

水貂志贺氏菌分离鉴定及药物敏感性分析

试验旨在对吉林省某水貂养殖场送检的3只具有典型腹泻症状的病死水貂的小肠和肠内容物样品进行细菌分离鉴定及耐药情况分析,为临床治疗提供参考。通过细菌分离纯化和PCR方法对分离菌株进行鉴定,对BALB/c小鼠进行菌液注射来检测菌株的致病性。采用K-B药敏法检测菌株对常用药物的敏感性,并通过PCR方法检测其耐药基因和Ⅰ类整合子的携带情况。结果显示,分离得到3株志贺氏菌,致病性检测试验显示分离菌可引起小鼠腹泻。药物敏感性试验结果显示,3株志贺氏菌对氟喹诺酮类药物、头孢类药物、氟苯尼考和多黏菌素较敏感,对氨基糖苷类、四环素、氯霉素、青霉素、氨苄西林耐药。耐药基因检测结果显示,3株志贺氏菌共检测出7种耐药基因blaTEM-1、aadA1、aac(3′)-Ⅱc、aac(6′)-Ⅰb、aph(3′)-Ⅶ、tet(M)、cat2及携带aadA1基因盒的Ⅰ类整合子。结果表明,分离的3株志贺氏菌均具有致病性,可引起小鼠腹泻,主要表现为多重耐药现象,携带的耐药基因呈多样性,为临床治疗带来巨大影响。

牛巴泰病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

本研究以牛巴泰病毒(BATV)NM/12株作为诊断抗原,初步建立了BATV间接酶联免疫吸附试验(ELISA)的检测方法,并对反应条件进行初步优化。结果表明,该方法对赤羽病毒阳性血清、牛布鲁氏杆菌阳性血清、牛病毒性腹泻阳性血清无交叉反应,仅与BATV阳性血清发生特异性反应,表明其特异性较强;经敏感性试验测定,阳性血清1∶640倍稀释时检测仍为阳性,显示其敏感性高。应用该方法对内蒙古自治区、黑龙江省和吉林省的523份牛血清进行牛巴泰病毒血清流行病学调查,总阳性率为10.7(56/523),阳性检出率与临床普遍使用的中和试验符合率为100%。本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,为牛群抗体检测和BATV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。

狐狸三聚氰胺和三聚氰酸混合物急性中毒及蓄积毒性

通过口服不同剂量的三聚氰胺和三聚氰酸混合物人工染毒,以雄性狐狸血浆、尿液、肝脏和肾脏中的代谢动力学和组织病理变化为研究指标,考察三聚氰胺和三聚氰酸对狐狸急性中毒及蓄积毒性的影响。结果显示,染毒后的狐狸出现食欲低下、骚动等临床症状,在血浆、尿液、肝脏和肾脏中检测到毒物的残留;同时,病理切片证实,毒物对肝脏血管和肾小球造成病例损伤。

吉林某牛场牛病毒性腹泻流行病学调查及分析

为全面了解吉林省某规模化牛场牛病毒性腹泻(BVD)的流行情况,试验采集临床血清样品157份,粪便样品18份,肝脏、精液等组织样品17份,应用BVDV抗体检测试剂盒进行血清抗体检测,利用BVDV1型引物,采用纳米PCR方法对血清及临床样品进行BVDV抗原检测,对抗原阳性样品进行测序分析;将抗原阳性样品经研磨、稀释后用0.22μm滤膜过滤除菌,接入牛肾细胞(MDBK)进行病毒分离培养,盲传3代后再次进行抗原检测;采用免疫荧光技术检测病毒对MDBK细胞的侵染作用;利用Mega软件绘制系统进化树并进行同源性比对分析。结果显示,该牛场临床血清BVDV抗体阳性率为77.1%,血清抗原阳性率为12.1%,临床粪便等样品抗原阳性率为74.3%;病料接入细胞未观察到细胞病变,分离毒株PCR产物测序分析结果与样品抗原检测结果一致;免疫荧光检测结果显示,分离株毒液正常吸附于MDBK细胞中,有明显荧光反应;抗原测序分析显示,该牛场BVD主要流行毒株与BVDV JL-1株同源性高达99.0%,且均为BVDV 1型毒株。本研究对该牛场BVDV流行情况进行了全面调查,为开展净化工作奠定了基础。

狂犬病病毒感染小鼠原代神经元细胞模型的建立

为了探究狂犬病病毒致神经系统症状的分子机制,本研究首先成功建立了高纯度胎鼠脑原代神经元细胞培养体系,进而通过使用实验室弱毒株SAD与固定毒株CVS11两种不同毒力的狂犬病病毒分别感染原代神经元细胞,评估这两种病毒在原代神经元细胞的最佳感染条件与病毒生长特性,建立不同毒力狂犬病病毒感染原代神经元细胞模型。在此基础上,通过Western blot技术检测狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白以及神经囊泡循环的相关蛋白表达变化情况,结果显示固定毒株CVS11感染神经元细胞导致VAMP2蛋白表达量减少。本研究为进一步研究狂犬病病毒感染宿主致神经系统症状的机制奠定了研究基础。

RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因真核表达载体构建及生物信息学分析

为深入研究Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family,member A,Rhoa)和环氧合酶2(cyclooxygenase 2,Ptgs2)分子在布鲁菌逃逸机体免疫中发挥的作用,试验对RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因进行扩增与克隆,构建真核表达载体并预测生物信息学功能。根据GenBank数据库中公布的RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因CDS区序列(登录号:JN971019.1和NM_011198)设计引物,提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,经RT-PCR扩增Rhoa和Ptgs2片段并测序,将纯化的Rhoa和Ptgs2片段分别与线性化pcDNA3.1质粒相连接,对重组质粒进行测序分析和双酶切鉴定后,利用LipofectamineTM2000转染293T细胞,经实时荧光定量PCR和Western blotting验证Rhoa和Ptgs2基因的表达情况,并应用生物信息学软件对Rhoa和Ptgs2基因进行预测分析。结果显示,试验成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达质粒;实时荧光定量PCR检测均在转录水平上表达;Western blotting可见Ptgs2蛋白在70 ku处有一明显条带,而Rhoa蛋白未出现条带。生物信息学预测显示,Rhoa和Ptgs2基因核苷酸序列相似性较高,在不同物种之间较为保守;Rhoa不具有信号肽,为不稳定蛋白,而Ptgs2在第17-18位氨基酸处存在信号肽,为稳定蛋白;Rhoa和Ptgs2蛋白分别有12和53个潜在的磷酸化位点;二级结构、三级结构均以无规则卷曲为主。本研究成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达载体,均在转录水平上表达,并分析了其生物学功能,为后续开展RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因在布鲁菌免疫机制方面的研究提供了工具。

布鲁氏菌16M BtpA和BtpB真核表达载体的构建及在293T细胞中的表达

为了构建布鲁氏菌16M BtpA和BtpB真核表达载体,便于深入研究其在布鲁氏菌逃逸宿主免疫机制中发挥的作用。根据GenBank公布的布鲁氏菌16M BtpA和BtpB序列设计了特异性引物,并提取布鲁氏菌16M总RNA,将其逆转录成cDNA为模板,进行了PCR扩增,获得BtpA和BtpB目的片段,连接至pMD18-T进行克隆纯化,再与pcDNA3.1载体进行连接,经PCR、酶切和测序分析等方法鉴定后,利用Lipofectamine TM 2000脂质体转染至293T细胞,Western blot检测BtpA和BtpB蛋白的表达。结果显示,PCR扩增出了873 bp的BtpA基因片段和924 bp的BtpB基因片段,依次连至克隆载体pMD18-T和真核表达载体pcDNA3.1,经限制酶Eco RⅠ和XbaⅠ酶切验证正确,测序分析显示与GenBank公布的序列信息完全一致;Western blot检测结果显示,pcDNA3.1-BtpA-HA和pcDNA3.1-BtpB-HA分别在32 ku和35 ku处出现了条带,与预期结果完全相符,说明能在293T细胞中表达。成功构建了pcDNA3.1-BtpA-HA和pcDNA3.1-BtpB-HA真核表达载体,并证实了其能在293T细胞中表达,为后续研究其作用与机制提供了材料。

新型CPV-2在我国貉群中爆发

2016~2018年,我国河北省、山东省等毛皮动物养殖地区爆发了貉细小病毒病,主要发生在2~4月龄幼貉中,患病貉以厌食及剧烈腹泻为主要临床症状,剖检可见小肠及肠系膜淋巴结广泛性出血,病程后期多因脱水及电解质失衡而死亡,病死率可达30%。特种动物疫病防控青年科技创新团队对我国发生的貉细小病毒病开展了病原学流行病学调查,并通过病原分离鉴定和动物回归试验,确定目前我国流行的貉细小病毒(Raccoondogparvovirus,RDPV)属于原始犬细小病毒2 型(Canineparvovirustype2,CPV-2)。

犬瘟热病毒感染雪貂的临床症状及其治疗探究

犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的高死亡率的烈性传染病,对宠物、毛皮动物及野生动物有较大的影响。接种疫苗是预防CD的主要措施,但部分动物接种疫苗后仍有发病现象。目前多采用抗病毒和消炎结合的方式对CDV感染发病的动物进行治疗,但药物搭配方案需要优化以发挥更好的治疗效果。为了评估感染CDV后发病特点和治疗方案,该研究通过CDV感染后临床症状赋分标准设置、淋巴细胞数和排毒时间检测、病变观察以及治疗效果评价,建立了雪貂CDV感染的临床症状指标体系。试验结果显示,雪貂体重变化率在接毒后第8天超过10%(P<0.05);第5~14天直肠温度39.5~40.0℃;第9天发现脓性分泌物;少量红疹第8天出现;第7天后出现食欲废绝,第9天发现抽搐、转圈等神经症状;第6天发现腹泻,第7天发现呕吐,第9天出现便血。犬瘟热症状分数在接毒后0~3 d、4~6 d、7~9 d、10~14 d分别为0.5、6、12.25和14。雪貂淋巴细胞数在第7天下降到2.2×10^(3)/μL(P<0.05)。从第3天开始排毒直到试验结束。剖检可见脑轻微出血、肝肿胀和出血、脾充血、肺红肿并充血、肾肿大并发炎、肠有出血。经CDV抗体血清(0.5 mL,1次/d)、拜有利(0.1 mL,1次/d)、安乃近(0.5 mL,2次/d)、盐酸肾上腺素(0.1 mL,休克时使用)、维生素B_(1)和维生素B_(12)(0.5 mL,1次/d)联合给予的方式治疗感染雪貂,结果显示症状在治疗11 d后消失。以上研究结果表明,雪貂感染CDV后临床症状程度与淋巴细胞数、排毒和剖检结果相关,该研究选用的治疗方案对CDV感染雪貂有较好的治疗效果,为雪貂犬瘟热感染的早期诊断和治疗提供重要的参考。

牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR与LAMP及PCR检测方法的对比研究

本研究应用金纳米颗粒与PCR结合建立了牛传染性鼻气管炎病毒(BoHV-1)纳米PCR(nanoPCR)新型检测方法和LAMP可视化检测方法,并与普通PCR方法进行对比研究。建立的BoHV-1纳米PCR新型分子检测方法和LAMP方法,特异性良好,敏感性与LAMP方法和常规PCR对比结果显示,nano-PCR方法敏感性是LAMP和普通PCR的10倍,最低检出量为2.23×102copies/L,是普通PCR的100倍;LAMP样品检测用时最短,50 min即可得到检测结果。临床样品的阳性检出率nano-PCR方法最高,检出阳性样品8/10份(弱阳性1份),普通PCR阳性检出率最低,检出阳性样品3/10份,LAMP检出6/10份。结果表明,nano-PCR敏感性和特异性更适合于临床样品的检测。